血管內(nèi)皮生長因子調(diào)控胃癌及膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移作用的實驗研究.pdf

1、研究背景和意義
　　 惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段的復(fù)雜過程。癌變的細(xì)胞和組織會發(fā)生一系列的變化,包括細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤生長、血管及淋巴管的誘導(dǎo)生成及癌細(xì)胞擴(kuò)散到循環(huán)系統(tǒng):然后在靶器官中粘附、侵襲和增殖。目前已經(jīng)有數(shù)種細(xì)胞因子被證實參與腫瘤的轉(zhuǎn)移；其中,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)不僅參與腫瘤血管的生成,還參與傷口愈合及其他重要的病理過程。VEGF通過兩

2、種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤血管的生成,一是主要通過其同源性受體VEGFR2,二是通過非VEGFR途徑,其中包括整合素的上調(diào)和(或)激活。
　　 整合素是一種異二聚體跨膜蛋白,通過VEGF及其受體的協(xié)調(diào),能夠誘導(dǎo)細(xì)胞粘附于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)。整合素αvβ6在正常的上皮細(xì)胞幾乎不表達(dá),而在生長中的胚胎組織及許多上皮性惡性腫瘤中高表達(dá)。前期研究中,我們已經(jīng)證實了整合素αvβ6可用來作為胃癌預(yù)后的指標(biāo)之一

3、。另外,αvβ6在結(jié)腸癌中的表達(dá)可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)分泌的增加。在胃癌組織中,MMP-9可降解細(xì)胞外基質(zhì),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的播散和轉(zhuǎn)移。由此可見,αvβ6通過MMP-9降解ECM屏障和介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。
　　 有研究證實整合素與VEGF在細(xì)胞的粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有協(xié)同作用。整合素α1β1和α2β1可促進(jìn)VEGF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲作用。VEGF與

4、整合素共同參與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的侵襲。在結(jié)腸癌細(xì)胞中,α9β1阻斷抗體可以特異性的抑制VEGF-A誘導(dǎo)的血管生成。然而,整合素αvβ6在VEGF介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用尚未明確。
　　 VEGF-C是VEGF家族的新成員,是一種酪氨酸激酶受體,其主要表達(dá)在內(nèi)皮組織的淋巴系統(tǒng)內(nèi)。在一些惡性腫瘤,如:乳腺癌、胃癌以及肺癌中呈高表達(dá),并且有研究證實VEGF-C的表達(dá)與腫瘤的侵襲以及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但是很少研究VEGF-C在

5、膽管癌中的表達(dá)以及與膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。
　　 本次研究的目的是研究整合素αvβ6的表達(dá)和VEGF的關(guān)系,以及它們在體外對胃癌細(xì)胞侵襲性的影響；并且研究VEGF-C在膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中所起的作用。
　　 第一部分 VEGF及整合素αvβ6在胃癌中的表達(dá)
　　 目的：研究VEGF以及整合素αvβ6在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　 方法收集手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本,冰凍儲存于-80℃低溫冰箱中。應(yīng)用免

6、疫組化的方法檢測VEGF以及整合素αvβ6在胃癌組織的表達(dá)情況。體外培養(yǎng)胃癌AGS細(xì)胞,采用流式細(xì)胞技術(shù)、免疫熒光以及免疫沉淀檢測胃癌細(xì)胞中整合素的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：30例胃癌標(biāo)本的免疫組織化學(xué)分析顯示,其中26例VEGF染色陽性,13例整合素αvβ6染色陽性。其中VEGF以及整合素αvβ6均表達(dá)陽性的有10例標(biāo)本。流式細(xì)胞儀檢測胃癌AGS細(xì)胞中整合素αvβ6呈現(xiàn)高表達(dá),而且陽性率大于90％；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示AGS細(xì)胞

7、膜中整合素的表達(dá),而應(yīng)用免疫沉淀技術(shù)檢查蛋白水平整合素αvβ6的表達(dá)情況。
　　 結(jié)論： VEGF以及整合素αvβ6在胃癌組織中均有表達(dá)；整合素αvβ6在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)。
　　 第二部分 VEGF介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲作用與整合素αvβ6相關(guān)
　　 目的：探討整合素αvβ6在VEGF促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的作用,尋求控制胃癌轉(zhuǎn)移的靶點。
　　 方法體外培養(yǎng)AGS細(xì)胞,外源性VEGF(30

8、ng/ml)刺激24h,應(yīng)用流式細(xì)胞儀、Real-time PCR、Western blot以及免疫沉淀檢測整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 再應(yīng)用體外培養(yǎng)的AGS細(xì)胞,分別用ERK通路阻斷劑U0126以及鼠抗人整合素αvβ6單克隆抗體10D5預(yù)處理后,外源性VEGF(30ng/ml)刺激24h,收集細(xì)胞并檢測整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)變化。<

9、br>　　 針對人整合素基因序列設(shè)計其特異性siRNA序列。用熒光標(biāo)記的陰性對照siRNA篩選轉(zhuǎn)染條件,按照預(yù)實驗篩選的轉(zhuǎn)染條件將β6 siRNA轉(zhuǎn)染到無血清培養(yǎng)液處理過的AGS細(xì)胞中,48h后收集細(xì)胞進(jìn)行抑制效應(yīng)分析,熒光定量PCR檢測β6 mRNA的表達(dá),以無血清培養(yǎng)基及對照siRNA為對照。AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染β6 siRNA成功后,采用外源性VEGF刺激,收集細(xì)胞檢測整合素β6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)。<

10、br>　　 趨化小室試驗檢測外源性VEGF介導(dǎo)的AGS細(xì)胞侵襲能力。p6 siRNA轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞,以及分別用ERK通路阻斷劑U0126以及鼠抗人整合素αvβ6單克隆抗體10D5預(yù)處理的AGS細(xì)胞,加入包被好的小室上層,在有無外源性VEGF介導(dǎo)的情況下,觀察轉(zhuǎn)移到小室下層的細(xì)胞個數(shù),從而反應(yīng)其不同條件下的侵襲能力。
　　 結(jié)果：應(yīng)用免疫沉淀、流式細(xì)胞儀以及細(xì)胞免疫熒光,可以發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的AGS細(xì)胞內(nèi)有整合素αvβ6的表達(dá),其

11、主要表達(dá)在細(xì)胞膜,而且表達(dá)的陽性率在90％以上。AGS細(xì)胞在外源性VEGF(30ng/ml)刺激24h后,整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)明顯增加,與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義。而應(yīng)用ERK通路阻斷劑U0126以及鼠抗人整合素αvβ6單克隆抗體10D5預(yù)處理后。外源性VEGF(30ng/ml)刺激24h,整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)顯著被抑制,與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意

12、義。熒光顯微鏡觀察見篩選后的轉(zhuǎn)染條件下熒光標(biāo)記siRNA的轉(zhuǎn)染效率較高,超過90％。在β6 siRNA轉(zhuǎn)染的無血清培養(yǎng)液處理過的AGS細(xì)胞中,在有無外源性VEGF作用的條件下,整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)得到相同的結(jié)論。趨化小室實驗檢測到在外源性VEGF介導(dǎo)的情況下,轉(zhuǎn)移至小室下層的AGS細(xì)胞數(shù)明顯增加。而應(yīng)用ERK通路阻斷劑U0126、鼠抗人整合素αvβ6單克隆抗體10D5以及β6 siRNA轉(zhuǎn)染

13、預(yù)處理后,轉(zhuǎn)移至小室下層的AGS細(xì)胞數(shù)顯著減少,與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：胃癌AGS細(xì)胞內(nèi)有整合素αvβ6的表達(dá)；外源性VEGF(30ng/ml)作用于AGS細(xì)胞后,可以刺激整合素αvβ6、P-ERK和MMP-9在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)顯著增加以及提高AGS細(xì)胞的侵襲能力,而且這種作用可以被ERK通路阻斷劑U0126、鼠抗人整合素αvβ6單克隆抗體10D5以及β6 siRNA轉(zhuǎn)染預(yù)處理顯著抑制,與對照組相比具

14、有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明整合素αvβ6參與了VEGF介導(dǎo)的胃癌侵襲轉(zhuǎn)移作用,并且ERK通路在此過程中起著一定的作用。
　　 第三部分 VEGF-C在膽管癌中的表達(dá)及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究
　　 目的：研究 VEGF-C在膽管癌癌組織中的表達(dá)情況及促進(jìn)膽管癌癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的作用。
　　 方法收集手術(shù)切除的膽管癌組織標(biāo)本,冰凍儲存于-80℃低溫冰箱中。應(yīng)用免疫組化的方法檢測VEGF-C在膽管癌組織的表達(dá)情況,回顧性分

15、析這些病人的臨床病例資料,并與免疫組化結(jié)果相結(jié)合,分析VEGF-C的表達(dá)與患者臨床資料之間的關(guān)系:體外培養(yǎng)膽管癌FRH-0201細(xì)胞,并且在有無外源性VEGF-C作用的情況下,采用增殖實驗以及趨化小室實驗檢測膽管癌細(xì)胞FRH-0201的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 結(jié)果： VEGF-C在膽管癌組織中呈高表達(dá),表達(dá)率約為75.4％；其表達(dá)與病人的年齡、性別以及腫瘤大小、腫瘤的臨床分期無明顯關(guān)系,而與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。膽管癌細(xì)胞在外