NGF促周圍神經(jīng)損傷修復(fù)支架的制備及其性質(zhì)研究.pdf

1、由各種外傷原因所導(dǎo)致的周圍神經(jīng)損傷或者斷裂,會(huì)給傷者造成肢體感覺和運(yùn)動(dòng)功能的下降或者喪失。對(duì)于周圍神經(jīng)斷裂類的損傷,若斷裂缺口較大時(shí),就須借助于對(duì)缺口進(jìn)行橋接移植手術(shù)才能使斷裂了的周圍神經(jīng)得到再生修復(fù)。目前采用的移植體有自體移植體和神經(jīng)支架,但自體移植來源有限且會(huì)帶來供體部位的后遺癥。在神經(jīng)支架研究方面,由于非降解材料可能導(dǎo)致神經(jīng)壓迫和二次手術(shù)的必要性,所以近年的工作主要趨向于生物可降解支架材料的研究和開發(fā)。截至2006年底,美國FDA

2、已經(jīng)批準(zhǔn)了NeuraGen、SaluBridge、Neurolac、Neuro Matrix、Neuroflex和Neurotube等品牌的神經(jīng)導(dǎo)管用于臨床;我國也有幾家單位正在申報(bào)國家三類醫(yī)療器械批文。盡管如此,由于所使用的材料不同,其促周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的效果也很有差異;同時(shí),它們基本都不適用于長段神經(jīng)缺損的修復(fù),故開展神經(jīng)支架的研究仍有必要。基于以上原因,本論文擬研制出一種以豬皮來源的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)粉末和聚乳酸-聚羥基乙酸共聚

3、物(PLGA)為主要原料、對(duì)神經(jīng)生長因子(NGF)有緩慢釋放功能的促周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的支架;通過體外檢測(cè)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來評(píng)估其作為促周圍神經(jīng)損傷修復(fù)支架的可行性。具體內(nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面:①制備出了豬皮來源的ECM粉末。經(jīng)H.E染色及掃描電子顯微鏡觀測(cè),沒有觀測(cè)到細(xì)胞殘留;經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,未檢測(cè)到核酸殘留。②制備出了具有生物活性的NGF明膠微球。經(jīng)激光粒徑分布儀檢測(cè),微球的粒徑介于1μm和20μm之間,平均粒徑主要分布在8μm和1

4、2μm之間;毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果顯示微球?qū)GF的封載率為80.50％。③通過添加弱堿性物質(zhì),達(dá)到了中和PLGA在降解過程中所產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物以穩(wěn)定組織pH的目的。對(duì)于純的PLGA,隨著降解時(shí)間的推移,降解液的pH值逐漸下降;不同種類的弱堿性調(diào)節(jié)劑與PLGA復(fù)合后都能對(duì)降解液的pH起到一定的調(diào)節(jié)作用,但效果各異;相同種類的弱堿性添加劑對(duì)降解液pH的影響與添加百分比相關(guān);碳酸氫鈉的調(diào)節(jié)作用最明顯,使降解液的pH值一直處于堿性狀態(tài);殼聚糖的調(diào)節(jié)

5、功效相對(duì)較平穩(wěn)緩慢,使降解液的pH值一直處于酸性狀態(tài)和平穩(wěn)下降趨勢(shì);而堿性氨基酸添加劑的作用則處于中間狀態(tài),先使降解液上調(diào)成堿性,然后再下調(diào)為酸性,使降解液的pH值保持在中性附近;當(dāng)組氨酸的添加量為5%和10%時(shí),對(duì)降解液pH的影響差異不顯著;而當(dāng)添加劑為精氨酸和賴氨酸時(shí),在高添加劑量下其對(duì)降解液pH值的影響比在低添加劑量下的作用更顯著;當(dāng)賴氨酸的添加量為5%時(shí),在試驗(yàn)考察期內(nèi),其使降解液的pH值保存在7.28～6.62間,是最適合的添

6、加方式。④通過對(duì)由PLGA和ECM的不同混合比例所制備的支架進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),隨著支架中ECM含量的增加,材料中的孔隙的在形態(tài)及孔徑的大小分布上越不均勻;材料的斷裂強(qiáng)度逐漸增大,當(dāng)ECM含量在達(dá)到20-30%時(shí)為最大值,然后逐漸降低;材料的斷裂伸長率逐漸降低;吸水率逐漸增大;失重率逐漸增大;降解速率逐漸增大。綜合評(píng)價(jià)認(rèn)為,材料中ECM的最佳含量應(yīng)在20-30%。⑤通過對(duì)不同組織工程原材料的篩選以及配伍比例的探討和制備方法的摸索,制備出了目標(biāo)

7、支架。⑥體外測(cè)試結(jié)果顯示,本目標(biāo)支架的斷裂強(qiáng)度為8.308MPa,斷裂伸長率為38.98%,彈性模量為77.27 MPa。掃描電子顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn),支架中PLGA和ECM發(fā)生了物理共混并形成了蜂窩狀結(jié)構(gòu)。在8周的考察期內(nèi),支架質(zhì)量損失了15.6%,羥脯氨酸的累計(jì)釋放率為62.8%。在第30d仍能檢測(cè)到支架對(duì)NGF的釋放。掃描電子顯微鏡觀測(cè)結(jié)果顯示雪旺氏細(xì)胞(SC)能夠在支架上粘附、穿行。⑦動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本目標(biāo)支架在兔坐骨神經(jīng)部

8、位生物相容性良好,無炎癥反應(yīng),無過敏反應(yīng)。通過對(duì)動(dòng)物實(shí)施本目標(biāo)支架移植后,在術(shù)后第5周術(shù)部神經(jīng)實(shí)現(xiàn)了愈合,在術(shù)部神經(jīng)的愈合中有雪旺氏細(xì)胞的參與。綜上所述,本支架具有對(duì)NGF進(jìn)行緩慢釋放的功能并保持了NGF的生物活性;無細(xì)胞毒性,并對(duì)雪旺氏細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用;其三維結(jié)構(gòu)為雪旺氏細(xì)胞在支架中的穿行提供了前提;其力學(xué)指標(biāo)和生物可降解特性符合神經(jīng)支架的要求;在支架中添加弱堿性物質(zhì)是中和PLGA在降解過程中所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)的有效方法。本支架的力