基于RNA-seq的寒蘭SSR標(biāo)記開發(fā)和開花基因挖掘.pdf

1、蘭科植物是最進(jìn)化的單子葉植物類群，分布區(qū)域廣，生態(tài)環(huán)境多樣，形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理特性均高度特異，是進(jìn)行花發(fā)育研究的理想材料。寒蘭（Cymbidium kanran）隸屬于蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium），是國蘭家族的重要成員，具有唇瓣形態(tài)變異多樣，四季開花和花期長等特點，被譽為“蘭中之王”。然而，包括寒蘭在內(nèi)的蘭科植物從種子到開花所需時間非常長，嚴(yán)重地制約了花發(fā)育的相關(guān)研究以及資源開發(fā)。目前試管開花的體系在很多蘭科植

2、物中已建立起來，但花芽誘導(dǎo)率及后續(xù)生殖生長情況還有待改善，并且試管開花的誘導(dǎo)增加了操作的成本和技術(shù)難度，所以寒蘭開花分子機制的研究對其發(fā)展具有重要意義。
　　本文擬對寒蘭進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組De Novo測序，獲得參考序列，然后對寒蘭開花各個階段的頂芽進(jìn)行數(shù)字化基因表達(dá)譜（Digital gene expression profiling;DGE）分析，篩選差異表達(dá)的基因，再利用實時熒光定量PCR（Quantitative real-tim

3、e reverse-transcription polymerase chain reaction;RT-qPCR）對所得的差異基因進(jìn)行驗證，初步揭示了寒蘭開花的分子機制。研究結(jié)果為寒蘭開花的分子調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)，也為蘭科植物的花期調(diào)控提供了依據(jù)。主要結(jié)果包括：
　　1.利用Solexa/Illumina二代高通量測序平臺，對寒蘭根、莖、葉和花四部分混合樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，得到有效序列108,927,860nt，經(jīng)過組裝獲得Un

4、igene68,699條，平均長度是867nt。
　　2.利用寒蘭轉(zhuǎn)錄組文庫中68,699條Unigene進(jìn)行SSR位點分析，共獲得位點11,646個，占16.95％。隨機選取141對SSR引物，其中79對可以擴增出特異條帶，擴增率達(dá)到56.03%，可以擴增出具有多態(tài)性條帶的引物共15對，達(dá)10.64%。
　　3.對寒蘭三個時期的花芽進(jìn)行DGE分析，通過對三個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的比較，共獲得23,720個差異表達(dá)基因，從中篩選出與

5、成花過程有關(guān)的9個基因，分別為：CkFPA，CkGA2OX，CkGID1，CkCO，CkPHYB，CkELF3，CkFRI，CkFLC和CkAP1。
　　4.通過RT-qPCR技術(shù)，驗證9個差異表達(dá)基因在寒蘭成花過程中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)其中CkFPA，CkGA2OX，CkCO，CkFLC和CkAP15個基因在寒蘭開花過程呈現(xiàn)顯著差異及規(guī)律的表達(dá)模式，表明其與寒蘭開花密切相關(guān)。
　　綜上所述，寒蘭成花是由自主途徑、赤霉素途徑、光