mdr-1 shRNA、Nef逆轉(zhuǎn)K562-A02細(xì)胞MDR及增強(qiáng)STI571對耐藥細(xì)胞敏感性的研究.pdf

1、研究背景: 化療藥物治療腫瘤失敗的主要原因是腫瘤細(xì)胞對藥物產(chǎn)生耐藥性。多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細(xì)胞接觸一種抗癌藥物后產(chǎn)生的對多種結(jié)構(gòu)和功能迥異的抗癌藥物的耐受性。MDR的發(fā)生涉及多種機(jī)制，其中以腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)mdr-1基因編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員膜P-糖蛋白為主要的機(jī)制。MDR藥物調(diào)節(jié)劑或增敏劑能通過抑制P-gp的外泵功能來阻止MDR的發(fā)生。但是它們的心臟毒性、免疫抑制、高膽紅素血癥、腎臟毒性等嚴(yán)重毒性和不良反應(yīng)限制了

2、臨床應(yīng)用。另外，腫瘤細(xì)胞對這類化療增敏劑同樣能產(chǎn)生再次耐藥。因此有必要探尋毒性更低、更有效的方法來逆轉(zhuǎn)MDR。 在以往的研究中，反義寡核苷酸能有效地逆轉(zhuǎn)P-gp參與的MDR。而且核酶技術(shù)亦能有效地下調(diào)mdr-1 mRNA的表達(dá)。而近年來，RNA干擾(RNAi)由于其高效性，高特異性，高穩(wěn)定性，可遺傳性及RNAi在有效地沉默靶基因的同時，對細(xì)胞本身的調(diào)控系統(tǒng)沒有影響等這些特點(diǎn)，越來越為人們重視。RNA干擾是利用雙鏈RNA(dsRN

3、A)誘導(dǎo)序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠到人類的幾乎所有真核生物中。從低等生物到高等動物廣泛存在RNA干擾機(jī)制，這說明RNA干擾機(jī)制在進(jìn)化的很早階段就已經(jīng)產(chǎn)生，是生物體進(jìn)化過程中的一種保守機(jī)制。RNA干擾機(jī)制經(jīng)過了千萬年選擇與進(jìn)化，是一種古老而多能的細(xì)胞水平的監(jiān)督系統(tǒng)(細(xì)胞內(nèi)的免疫系統(tǒng))。通過此系統(tǒng)，細(xì)胞可以去除不需要的mRNA，降解畸變的RNAs，以及抑制如病毒、

4、轉(zhuǎn)基因、移位元件等的外源基因成分。RNAi技術(shù)利用外源性雙鏈RNA，產(chǎn)生約21～23個堿基大小的有活性的小干擾RNA(siRNA)，誘導(dǎo)產(chǎn)生序列特異性基因沉默。其作用類似于基因敲除，但技術(shù)上更為簡單、快捷。有研究小組開發(fā)表達(dá)載體在瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)siRNA，一些載體經(jīng)過設(shè)計可以表達(dá)短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，在體內(nèi)加工后形成類似siRNA的分子，引發(fā)基因沉默。shRNA一般都是在RNA多聚酶Ⅲ(Pol Ⅲ)啟

5、動子和4～5個T的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間插入，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的第二個堿基處終止，然后折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，最后shRNA在體內(nèi)被加工處理成為siRNA，起始RNAi的過程。此類表達(dá)載體介導(dǎo)的基因沉默作用時間長而且更穩(wěn)定，甚至可長期抑制基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的質(zhì)粒載體能表達(dá)綠色熒光蛋白，有利于測定轉(zhuǎn)染效率，另外此載體帶有Rneo基因，可用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的G418篩選，為獲得帶有目的片斷的單細(xì)胞克隆提供了方便。 盡管RNAi具有抑制率

6、高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，但其轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率較低，而且siRNA干擾效應(yīng)具有濃度依賴性，其效應(yīng)隨濃度增高而增加，但是過量的dsRNA則會激活A(yù)DARs(RNA依賴的腺苷脫氨酶)的活性，通過脫氨基作用反而抑制RNAi。這些缺點(diǎn)影響了RNAi的干擾效應(yīng)。 由蓮心、黃芪等組成的拮新康是導(dǎo)師多年來潛心研制的中藥復(fù)方制劑。研究證明能增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性而逆轉(zhuǎn)MDR，而藥理研究表明蓮心中主要有效成分為甲基蓮心堿(Nef)，曾采用甲

7、基蓮心堿對K562／AO2多藥耐藥細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)甲基蓮心堿能增加阿霉素(ADM)在K562／AO2細(xì)胞內(nèi)的積聚濃度，降低mdr-1／P-gp基因表達(dá)而逆轉(zhuǎn)MDR。mdr-1 shRNA能否抑制K562／AO2細(xì)胞mdr-1／P-gp基因表達(dá)，甲基蓮心堿能否增強(qiáng)RNAi對mdr-1／P-gp的干擾效應(yīng)，值得深入探討。 酪氨酸激酶抑制劑STI57 1(格列衛(wèi))作為針對腫瘤發(fā)病特異的癌基因靶向分子設(shè)計的藥物，目前認(rèn)為是治療Ph陽性

8、慢性粒細(xì)胞白血病最有效的藥物。STl57l競爭bcr／abl酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)，選擇性抑制酪氨酸激酶的活性。STl571獲得性多藥耐藥已成為治療慢粒的難點(diǎn)。而P-gp表達(dá)上調(diào)在STI571獲得性多藥耐藥中起著一定的作用。逆轉(zhuǎn)P-gp參與的STI571耐藥，從而提高STl57l對慢粒白血病的療效具有一定的參考意義。 一、pEGFP—C1／U6質(zhì)粒介導(dǎo)的表達(dá)mdr-1 shRNA的質(zhì)粒構(gòu)建 目的：利用基因重組技術(shù)，用

9、pEGFP—CI／U6質(zhì)粒載體構(gòu)建介導(dǎo)mdr-1shRNA的表達(dá)質(zhì)粒。方法：針對mdr-1基因的19個堿基大小的片段，分別設(shè)計2對寡核苷酸，形成雙鏈后將其依次連入帶有U6啟動子的pEGFP-C1載體(命名為pEGFP—C1／U6)，兩對DNA雙鏈連接后形成中間由9個堿基序列間隔的反向互補(bǔ)序列，構(gòu)建成能產(chǎn)生mdr-l shRNA的質(zhì)粒。同時設(shè)計1對與人mdr-1基因無同源性的隨機(jī)寡核苷酸，構(gòu)建一陰性對照重組質(zhì)粒。結(jié)論：成功構(gòu)建了能表達(dá)md

10、r-1shRNA的質(zhì)粒載體pEGFP-C1／U6／A和pEGFP-C1／U6／B和一陰性對照質(zhì)粒pEGFP-C1／U6／neg，可能為臨床上逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥提供一種有效的方法。 二、mdr-1 shRNA對K562／A02細(xì)胞mdr-1／P-gp表達(dá)及功能的影響 目的：研究mdr-1 shRNA對K562／AO2細(xì)胞mdr-1／P—gp表達(dá)及功能的影響，為逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥提供新的方法與思路。方法：通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEG

11、FP-C1／U6／A、pEGFP-C1／U6／B和pEGFP-C1／U6／neg至K562／AO2細(xì)胞株，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-Blot)技術(shù)檢測mdr-1／P-gp表達(dá)的改變。四唑鹽法(MTT法)檢測阿霉素對K562／AO2細(xì)胞增殖的影響。HPLC法觀察質(zhì)粒pEGFP-C I／U6／A、pEGFP-C 1／U6／B和pEGFP-C 1／U6／neg對K562／AO2細(xì)胞內(nèi)阿霉素積聚濃度

12、的影響。結(jié)論：mdr-1 shRNA可明顯抑制K562／AO2細(xì)胞mdr-1／P-gp的表達(dá)，增加K562／AO2細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量，恢復(fù)K562／AO2細(xì)胞對化療藥物的敏感性，逆轉(zhuǎn)mdr-1基因編碼蛋白P-gp介導(dǎo)的MDR。 三、mdr-1 shRNA聯(lián)合甲基蓮心堿對K562／AO2細(xì)胞mdr-1／P-gp表達(dá)及功能的影響 目的：研究mdr-1 shRNA聯(lián)合甲基蓮心堿對K562／A02細(xì)胞mdr-1／P-gp表達(dá)及功能

13、的影響,為更有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥探尋新的思路。方法:脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pegfp-c1/u6/b或聯(lián)用甲基蓮心堿處理k562/a02細(xì)胞,采用rt-pcr和western-blot技術(shù)檢測mdr-1/p-gp表達(dá)的改變。mtt法檢測阿霉素對k562/a02細(xì)胞增殖的影響。結(jié)論:甲基蓮心堿能顯著增強(qiáng)shrna表達(dá)載體對k562/a02細(xì)胞mdr-1/p-gp表達(dá)抑制作用,恢復(fù)k562/a02細(xì)胞對化療藥物的敏感性,逆轉(zhuǎn)mdr-1基因編碼蛋白

14、p-gp介導(dǎo)的多藥耐藥。 四、mdr-1 shrna及甲基蓮心堿在k562/a02細(xì)胞對st1571敏感性中作用的研究 目的:研究mdr-1 shrna、甲基蓮心堿在多藥耐藥白血病細(xì)胞k562/a02對st1571敏感性中的作用,并探討其逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制。方法:脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pegfp-c1/u6/b或聯(lián)用甲基蓮心堿處理k562/a02細(xì)胞株,mtt法檢測st1571對k562/a02細(xì)胞增殖的影響。rt-pcr和west