豬胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ在原核與真核生物中的表達(dá)研究.pdf

1、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(Insulin-like GrowthFactorI，IGF-I)是從血清中發(fā)現(xiàn)的一種多功能生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖、分化、生長(zhǎng)。研究證實(shí)，IGF-I對(duì)動(dòng)物繁殖及生長(zhǎng)性能提高具有促進(jìn)作用，同時(shí)對(duì)于多種疾病的治療及修復(fù)具有重要的作用。但I(xiàn)GF-I在血清中的含量很低，依靠純化天然的IGF-I根本無(wú)法滿(mǎn)足基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用需求。 本試驗(yàn)運(yùn)用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)及畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)分別進(jìn)行豬IGF-I(plG

2、F-I)基因體外表達(dá)研究，針對(duì)不同的表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)PCR克隆及體外合成拼接分別獲得目的基因，并將pIGF-I基因分別克隆至原核表達(dá)載體pGEX-KG及真核表達(dá)載體pPIC9K中，進(jìn)行表達(dá)研究，為利用IGF-I蛋白進(jìn)行基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 1．構(gòu)建pIGF-I成熟蛋白的原核表達(dá)載體，表達(dá)plGF-I成熟蛋白與GST蛋白的融合蛋白。利用已經(jīng)構(gòu)建好的含有plGF-I全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒，設(shè)計(jì)含有合適酶切位點(diǎn)的引物，應(yīng)用PCR技術(shù)

3、擴(kuò)增得到含有plGF-I信號(hào)肽與成熟蛋白序列的基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pGEX-KG中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR篩選、酶切鑒定和核苷酸序列測(cè)定，確定重組質(zhì)粒pKG-IGF-I構(gòu)建完全正確。將重組質(zhì)粒pKG-IGF-I轉(zhuǎn)化宿主菌BL21 (λDE3)，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析表明，重組菌可表達(dá)分子量約為37 kDa的重組蛋白。 2．重組菌進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，菌體經(jīng)超聲波破

4、碎，SDS-PAGE電泳分析表明，目的蛋白主要以可溶性形式存在于裂解液上清中。上清經(jīng)不同飽和度硫酸銨分級(jí)純化后，與佐劑混合免疫新西蘭大耳兔，于第三次加強(qiáng)免疫后，耳緣靜脈采血，瓊脂糖擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)。從心臟采血分離的血清，經(jīng)ELISA檢測(cè)，抗體的效價(jià)達(dá)1:800。 3．采用酵母偏愛(ài)密碼子合成五條編碼plGF-I基因的引物，利用重疊PCR技術(shù)拼接獲得長(zhǎng)度為210bp的豬IGF-I成熟蛋白基因。在基因兩端引入合適的酶切位點(diǎn)，將該基