沉默CD133基因?qū)D133+肝癌干細胞放射敏感性的影響.pdf

1、實驗?zāi)康模豪寐《境聊珻D133基因探討其對人肝癌CD133+-HepG2干細胞放射敏感性的影響。
　　 第一部分:CD133+-HepG2細胞的分選及“干性”鑒定
　　 實驗方法:利用免疫磁珠分選技術(shù)從HepG2肝癌細胞系中分選出CD133+及CD133-細胞亞群，并用流式細胞術(shù)檢測分選前后CD133的表達率;對分選得到的CD133+-HepG2肝癌細胞進行體外成球能力及NOD/SCID小鼠皮下成瘤能力檢測，并取皮下

2、移植瘤進行HE染色觀察腫瘤組織結(jié)構(gòu);克隆形成試驗對比CD133+細胞與CD133-細胞克隆形成能力。
　　 實驗結(jié)果:從HepG2肝癌細胞系中利用免疫磁珠分選技術(shù)成功分選出CD133+與CD133-細胞，并用流式細胞術(shù)檢測HepG2細胞的CD133基礎(chǔ)表達率為(1.36±0.20)％，通過分選后CD133表達率上升到(87.62±1.92)％。隨后無血清培養(yǎng)結(jié)果顯示CD133+HepG2細胞能在含EGF、FGF、LIF的無血清培

3、養(yǎng)液中能成球生長，而CD133--HepG2細胞則無法在相同的培養(yǎng)液中生存。小鼠皮下成瘤實驗結(jié)果顯示1×103個CD133+細胞即可在NOD/SCID小鼠皮下形成移植瘤，而相同條件下CD133細胞均也不能成瘤。HE染色結(jié)果顯示，由CD133+細胞形成的皮下移植瘤在顯微鏡下組織細胞呈排列致密，細胞核清晰可見。平板克隆形成試驗顯示，CD133+細胞比CD133細胞具有更強的克隆形成能力，其克隆形成率為:35.03±2.35％，而CD133-

4、細胞克隆形成率僅為:6.4±0.72％。兩者具有顯著差異，P＜0.01。
　　 實驗結(jié)論:上述實驗結(jié)果表明通過免疫磁珠分選得到的CD133+-HepG2細胞比CD133--HepG2細胞具有更強的體外成球和體內(nèi)成瘤能力及克隆形成能力，是具有腫瘤干細胞特性的肝癌細胞亞群。
　　 第二部分攜帶CD133干擾序列的慢病毒感染CD133+-HepG2
　　 實驗方法:利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，以CD133基因為沉默

5、靶點，按預(yù)實驗得出的MOI值20對CD133+-HepG2肝癌細胞進行感染，以轉(zhuǎn)染shCD133組為實驗組、轉(zhuǎn)染shNC組為陰性對照組，未處理的CD133+-HepG2細胞為空白對照組;3天后在熒光顯微鏡下觀察慢病毒的感染效率;克隆形成實驗檢測三組細胞克隆形成能力;RT-PCR和Western Blot檢測三組細胞CD133 mRNA及蛋白的表達;
　　 實驗結(jié)果:接種慢病毒后3天，在倒置熒光顯微鏡觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的

6、表達，第5天達到高峰，其感染陽性效率達80％以上:克隆形成實驗結(jié)果顯示沉默CD133后的CD133+肝癌干細胞增殖能力明顯減弱(P＜0.01);RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示慢病毒介導(dǎo)的CD133shRNA能有效下調(diào)CD133的mRNA和蛋白表達(P＜0.01);
　　 實驗結(jié)論:上述實驗結(jié)果表明慢病毒介導(dǎo)的shRNA能顯著下調(diào)CD133+肝癌干細胞CD133的表達，并能顯著抑制其增殖能力。
　　 第三部

7、分克隆形成實驗檢測各組細胞放射敏感性并探討其可能機制。
　　 實驗方法:采用克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成率(Platingefficiency PE)，PE=克隆數(shù)目/接種細胞數(shù)×100％，以及存活分數(shù)(survival fraction SF)，SF=受照射細胞的克隆形成率/對照組細胞克隆形成率×100％。繪制劑量存活曲線并計算放射生物學(xué)參數(shù)。利用流式細胞儀檢測三組細胞細胞周期及凋亡情況。
　　 實驗結(jié)果:陽性感染

8、組的劑量存活曲線較其他兩組整體下移。根據(jù)多靶單擊模型計算出各組SF2、D0、Dq及N值結(jié)果表明，陽性感染組的PE、SF、SF2、D0、Dq及N值均較空白組和陰性感染組明顯減小，其放射增敏比(SER)為:1.37±0.02。差異具有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01。流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期及凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性感染組其S期明顯減少G2期增多，細胞凋亡也明顯增加。差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05。
　　 實驗結(jié)論:沉默CD133基因后，CD