皮下免疫磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)對(duì)小鼠肺炎鏈球菌感染的保護(hù)效果和機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肺炎鏈球菌磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）是糖酵解途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)GAPDH不僅存在于細(xì)菌的胞內(nèi)也可以定位于細(xì)菌的表面，并且參與了其它的生理過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)及自噬。已有研究報(bào)道GAPDH在多種細(xì)菌中與細(xì)菌毒力密切相關(guān)，并且推測(cè)其可作為一個(gè)潛在的疫苗靶點(diǎn)。因此，本研究擬探索皮下免疫肺炎鏈球菌GAPDH對(duì)小鼠抵抗肺炎鏈球菌感染的保護(hù)效果，并進(jìn)一步探索發(fā)揮免疫保護(hù)作用的機(jī)制，為肺炎鏈球菌蛋白

2、疫苗的臨床前研究提供依據(jù)。
　　方法：
　　利用原核表達(dá)重組技術(shù)制備重組GAPDH（rGAPDH）蛋白，采用鎳柱純化后去除內(nèi)毒素(LPS)，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)排除殘留的LPS的干擾。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)皮下免疫rGAPDH及鋁佐劑共四次，每次間隔兩周，末次免疫后七天構(gòu)建肺炎鏈球菌敗血癥模型和定植模型，通過(guò)測(cè)定生存率及鼻腔灌洗液和肺勻漿中的細(xì)菌載量來(lái)評(píng)價(jià)rGAPDH的保護(hù)效果。在體外實(shí)驗(yàn)部分，用rGAPDH處理骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞（BMD

3、Cs）研究GAPDH發(fā)揮免疫保護(hù)作用相關(guān)的受體及信號(hào)通路。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)抗原特異性抗體效價(jià)、抗體亞型以及細(xì)胞因子的表達(dá)。利用蘇木精-伊紅（HE）染色分析肺組織切片炎性改變。采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析 BMDCs表面的共刺激分子以及細(xì)胞凋亡情況。用小分子抑制劑和Western blot分析rGAPDH激活BMDCs相關(guān)的信號(hào)通路。
　　結(jié)果：
　　成功制備GAPDH重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析，純

4、度在90%以上。用鱟試劑檢測(cè)殘留LPS濃度顯示低于0.1EU/ml，達(dá)到體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)要求。并且在體外的 LPS排除實(shí)驗(yàn)中證實(shí)重組蛋白中殘留的LPS不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)用rGAPDH皮下免疫小鼠后，小鼠可以產(chǎn)生較高的抗原特異性抗體。在敗血癥模型中，實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存率高于PBS對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在定植模型中，實(shí)驗(yàn)組小鼠鼻腔灌洗液和肺勻漿中的細(xì)菌載量均顯著低于 PBS對(duì)照組。
　　在體外試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)rGAP

5、DH可以引起B(yǎng)MDCs表面共刺激分子CD40、CD86和MHC II的高表達(dá)以及細(xì)胞因子IL-12p70、IL-6和TNF-α的釋放增加，提示rGAPDH能夠誘導(dǎo)BMDCs表型和功能的成熟。然而，用rGAPDH處理Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）缺陷鼠的BMDCs后，表面共刺激分子的表達(dá)和細(xì)胞因子水平與野生（WT）組相比顯著地降低，提示rGAPDH可能通過(guò)TLR2和TLR4發(fā)揮作用。后續(xù)的研究表明 rGAPDH