人臍帶間充質干細胞向造血細胞方向分化的研究.pdf

1、從世界完成首例造血干細胞移植到現(xiàn)在已經(jīng)有50年的時間了，這項技術已經(jīng)成為治療各類惡性血液病的最為有效的方法，每年全球移植病例數(shù)都在增加，接受這項技術治療的患者最長的無病生存時間已經(jīng)超過35年了。造血干細胞的成功植入是HSCT發(fā)揮治療作用的前提，在臨床治療中于宿主HLA不全相合、輸注造血干細胞數(shù)量不足、移植前大劑量化療致骨髓基質損傷嚴重及移植物抗宿主病發(fā)生均會導致造血干細胞植入失敗或植入延遲，從而使移植死亡率增加，使得該技術在實際應用中面

2、臨著很大困難。特別是在一些惡性血液病的治療中，由于長期、多次的輸入異體來源的HSC，極易引發(fā)致死性的肺損傷以及移植后感染。因此，解決HSCT中的HSC的來源以及其安全問題，獲得穩(wěn)定、高效的造血干細胞或具有造血潛能的細胞成為進一步推廣HSCT的關鍵，這不僅具有重要的醫(yī)學意義，而且將產(chǎn)生巨大的社會經(jīng)濟效益。
　　 以往的觀點認為，未分化細胞分化形成特定類型的終末細胞這一過程是不可逆的；但近幾年發(fā)育生物和干細胞技術的發(fā)展可以成功的將一

3、種類型的組織特異性細胞轉化形成另外一種類型的細胞。在HSCT的病人中也支持了這些觀點。HSCT數(shù)月后，可以在病人的骨髓或者造血組織中發(fā)現(xiàn)來源于宿主的表皮細胞、肝細胞，甚至還出現(xiàn)了消化管上皮細胞等。這些結果表明在體內環(huán)境中的人體干細胞在分化過程中存在著一定的不確定性。而現(xiàn)在的表觀遺傳學研究也為終末細胞之間的互相轉化提供了可能。也有實驗表明可以講表皮細胞或者其他細胞誘導成為造血系細胞。如果這些研究成果能夠成熟并且得以應用，將解決上面提到的H

4、SCT中出現(xiàn)的問題。間充質細胞是容易得到的較為幼稚的一類干細胞，而且具有多向分化潛能，可以在體外容易大量增殖，如果可以將間充質細胞成功誘導形成造血細胞，探明轉化的機制，將具有廣闊的應用前景。
　　 本課題擬以人臍帶間充質干細胞為誘導前體細胞，采用貼壁法和酶消化法獲得原代細胞，純化后再分選出較為均一的有多系分化潛能的多能干細胞群，經(jīng)過化學誘導的方法，改變其表觀遺傳學表達，對誘導后細胞進行形態(tài)、免疫學和造血功能等方面的檢測，探討其向

5、造血細胞方向分化的可行性。進一步研究細胞分化過程中MiRNA的表達變化，分析誘導后細胞內表觀遺傳學變化的方式和方法。與成體來源，如骨髓間充質干細胞相比，hUMSCs的幼稚程度更低，HLA抗原表達更弱，其擴增和多向分化能力也較強；與HSC相比，兩者都屬于來源于胚外中胚層的間充質組織，所以從理論上具有轉化的可能。以往在HSCT中MSC一直作為輔助使用細胞，但是如果能夠穩(wěn)定的將MSC誘導形成HSC，將解決HSCT中存在的來源不穩(wěn)定和異體移植的

6、問題，在臨床上發(fā)揮不可估量的作用。
　　 第一部分：人UMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定
　　 方法：
　　 (1)分別采用貼塊法和酶消化法獲得原代培養(yǎng)的hUMSCs，傳代純化后進行克隆化培養(yǎng)，培育出形態(tài)和增殖能力較為單一的細胞克隆。
　　 (2)光鏡及電鏡觀察hUMSCs克隆化后的形態(tài)學特點。
　　 (3)取第4代(P4)的hUMSCs進行免疫細胞熒光化學染色和流式細胞儀檢測間充質干細胞的標志性分子：V

7、imentin、α-SMA、Oct-4、Sox-2、HLA-1、CD29、CD34、CD133、CD44和CD45。
　　 (4)取P4hUMSCs進行流式細胞儀檢測細胞周期DNA含量。 (5)對克隆化hUMSCs進行體外細胞誘導分化，鑒定其脂肪與成骨細胞方向分化的潛能。
　　 結果：
　　 原代培養(yǎng)7d后可見培養(yǎng)瓶中有克隆樣生長的細胞團，經(jīng)過單一細胞的克隆化傳代培養(yǎng)后：
　　 (1)形態(tài)上呈梭形或紡錘形

8、，胞漿豐富；透射電鏡顯示，克隆化P4hUMSCs細胞核內異染色質較少，核仁明顯。
　　 (2)表面標志分子上，免疫熒光細胞化學檢測顯示，P4hUMSCs均表達間質細胞骨架蛋白Vimentin、早期平滑肌細胞表面標志物α-SMA、全能性轉錄因子Oct4和Sox2、間充質干細胞表面抗原CD29和CD44、其中23％的細胞表達CD133、5％細胞表達HLA-1、)。5％的細胞表達CD34和CD44。
　　 (3)細胞周期分析上

9、，hUMSCs85％以上細胞是處于靜止期，即G0/G1期，S+G2+M的細胞平均約占13％，符合干細胞細胞周期的特點。
　　 (4)單個細胞來源的P4hUMSCs在體外具有向骨細胞和脂肪細胞等終末細胞分化的潛能。
　　 結論：
　　 (1)我們所獲得的hUMSCs具備了間充質干細胞的大部分標記，而且CD133陽性率較高表明其中相對幼稚細胞數(shù)量較多，HLA-1陽性率較低表明源于臍帶組織的干細胞其免疫標記較弱，更適用

10、于干細胞移植過程。
　　 (2)hUMSCs可以向脂肪細胞和成骨細胞分化，表明其具有多向分化的潛能。
　　 第二部分：化學誘導hUMSCs向造血細胞方向分化
　　 方法：
　　 (1)hUMSCs向造血細胞方向體外分化誘導模型的建立：設立5-Aza與造血生長因子GF共同誘導為實驗組，GF誘導和為誘導組為對照組。實驗用基本培養(yǎng)基為甲基纖維素化培養(yǎng)基，誘導濃度設定在2.5μg/ml5-Aza，50ng/mlG

11、M-CSF和SCF，設定誘導后1d、3d、5d、7d和10d的不同觀測時間，盡可能提高CD34的陽性細胞比例。
　　 (2)對誘導后細胞進行表面標記的檢測：顯微鏡觀察誘導后細胞形態(tài)以及超微形態(tài)結構的改變；流式細胞儀檢測表面標記分子，包括CD34、CD45、CD133、CD11b、CD44和CD29；免疫熒光檢測細胞形態(tài)改變時細胞表達Hoxb4與Vimintin的情況；PCR反應檢測細胞內造血相關信號分子Hoxb4、Scl-1、W

12、nt3a和Gata2。
　　 (3)對誘導后細胞進行造血功能的檢測：利用經(jīng)典脾集落實驗，將誘導后的hUMSCs注射進入接收致死劑量照射的裸鼠體內，15d后檢測裸鼠的血常規(guī)、脾臟切片。
　　 結果：
　　 (1)隨著誘導時間延長，5-Aza/GF聯(lián)合誘導組中細胞懸浮于培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)出集落樣生長的形態(tài)。透射電鏡觀察，細胞內細胞器數(shù)量減少，細胞形態(tài)核質比進一步增大，核內染色質分布與造血細胞類似。
　　 (2)細

13、胞表面標記檢測：CD34、CD45和CD133細胞陽性比例隨著誘導時間延長而逐漸升高，CD29和CD44卻逐漸下降。對誘導5d后的細胞鋪片進行免疫熒光檢測，其中部分形態(tài)變圓的細胞核內已經(jīng)高表達Hoxb4，而仍為梭形的細胞其胞質內仍表達Vimintin；同時，PCR檢測造血信號表達可見Hoxb4、Scl-1、Wnt3a和Gata2的表達均隨著誘導天數(shù)的增加而增加。
　　 (3)造血功能檢測：脾集落實驗后，采集小鼠外周血，血常規(guī)分析

14、接種5-Aza/GF聯(lián)合誘導細胞組中的粒細胞升高較為明顯，有統(tǒng)計學意義；通過對小鼠脾臟切片染色分析，可見組織中有大量細胞表達HLA-1。
　　 結論：
　　 經(jīng)過5-Aza/GF聯(lián)合誘導后的hUMSCs，在形態(tài)上已經(jīng)不具備了間充質細胞的形態(tài)特點，逐漸與成體HSC類似，在表面分子標記上，已經(jīng)有很大一部分比例細胞開始表達造血干細胞的特異性分子CD34與CD45，而且更為原始的細胞標記CD133也有所上升，細胞形態(tài)發(fā)生改變后，

15、參與造血過程的胞內重要信號分子Hoxb4表達大大增多，而且通過脾集落實驗也可以證明誘導后的hUMSCs在體內具備了造血重建的功能。可見，在5-Aza/GF聯(lián)合誘導作用下，hUMSCs可以朝向造血細胞方向分化，具備了造血細胞形態(tài)特征和功能特點。
　　 第三部分：hUMSCs向造血細胞方向分化過程中相關MiRNA的變化
　　 方法：
　　 (1)根據(jù)MiRNA文庫預測以及相關文獻報道，挑選了miR-126、miR-4

16、51、miR-181a、miR-150和miR-218為主要研究對象，利用primer6.0生物學軟件設計以上5條RNA的逆轉錄和Realtime PCR引物。
　　 (2)收集5-Aza/GF聯(lián)合誘導3d、7d和10d的hUMSCs，以單獨GF誘導為實驗對照，以HSC和hUMSCs為陽性和陰性對照，RNA抽提試劑Trizol裂解收集的細胞抽提RNA。MMLV逆轉錄酶的作用下行逆轉錄反應，syberGREEN系統(tǒng)的realtim

17、e PCR反應，檢測不同時間點相關MiRNA的差異。
　　 (3)挑選表達差異較大的MiRNA，體外合成相關MiRNA片段，脂質體將其轉染進入培養(yǎng)的hUMSCs中，24h后RealtimePCR檢測其表達量的變化，利用甲基纖維素化培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，1w后收集轉染細胞，Western blot檢測造血相關因子Hoxb4的表達，驗證該MiRNA在造血分化過程中的作用。
　　 結果：
　　 (1)Realtime PCR

18、反應檢測miR-126、miR-451、miR-181a、miR-150和miR-218等MiRNA，在誘導后的hUMSCs內表達均有所增加，而且隨時間增加表達量進一步增加，其中以miR-218和miR-451增加較為顯著。
　　 (2)選取miR-218驗證其下游功能，將miR-218轉染進入hUMSCs細胞內，24h后細胞內miR-218表達升高，證明轉染有效。1w后細胞內造血相關因子HoxB4的表達量進一步升高。
　

19、　 結論：
　　 hUMSCs向造血細胞方向分化過程中miR-126、miR-451、miR-181a、miR-150和miR-218表達量均增高，其中miR-218對造血功能啟動具有一定意義。
　　 研究結論和意義：
　　 1.應用化學誘導的手段進行重編程以獲得專能干細胞。應用化學誘導的方法，設定多個濃度和參考條件，為獲得穩(wěn)定的造血細胞提供了更加可能的條件。
　　 2.從表觀遺傳學角度探明間充質類細胞