RPA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在轉(zhuǎn)基因水稻檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、自1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來(lái)，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已經(jīng)增長(zhǎng)超過(guò)100倍，涉及的轉(zhuǎn)基因物種也在逐年增加。對(duì)于轉(zhuǎn)基因生物安全，公眾的關(guān)注程度也越來(lái)越高，各國(guó)政府的監(jiān)管力度越來(lái)越強(qiáng)。我國(guó)的轉(zhuǎn)基因水稻研究一直比較活躍，然而作為大部分中國(guó)人的主糧，公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的接受程度還比較低。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)成為轉(zhuǎn)基因生物安全工作的熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。因此，建立一套快速、靈敏、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法是當(dāng)前十分必要的一項(xiàng)工作。
　　傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)法無(wú)

2、法滿足田間、野外等簡(jiǎn)陋環(huán)境中的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，因此，能克服此缺陷的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。在眾多的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，本研究選擇了重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification，RPA)。RPA技術(shù)是一種反應(yīng)溫度最接近室溫，快速、靈敏的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。它對(duì)DNA的擴(kuò)增溫度控制在25～42℃即可，反應(yīng)時(shí)間只要15～20 min。本研究利用RPA技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻mF-MH3301-1、轉(zhuǎn)基因水稻Bar6

3、8-1、轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15、轉(zhuǎn)基因水稻KMD1等我國(guó)自主研發(fā)的并具有產(chǎn)業(yè)化前景的四種轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行了研究。
　　本研究根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻mf-MH3301-1品系外源基因插入側(cè)翼序列，篩選到一組檢測(cè)效果好的引物和探針，建立了RPA的瓊脂糖凝膠電泳和RPA熒光快速檢測(cè)方法，RPA熒光快速檢測(cè)可穩(wěn)定檢測(cè)100拷貝的轉(zhuǎn)基因水稻mf-MH3301-1。
　　根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15品系和轉(zhuǎn)基因水稻Bar68-1品系的外源基

4、因側(cè)翼序列，分別篩選了一組引物探針組合，并分別建立了一套包含RPA瓊脂糖凝膠電泳、RPA熒光快速檢測(cè)以及RPA測(cè)流免疫試紙條快速檢測(cè)方法，其中RPA熒光快速檢測(cè)法的檢測(cè)限分別為500拷貝和50拷貝，RPA測(cè)流免疫試紙條法的檢測(cè)限分別為75拷貝和50拷貝。
　　針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻KMD1的檢測(cè)，本研究選取其外源基因5'端側(cè)翼序列，并設(shè)計(jì)篩選出特異引物，建立了該品系的RPA-瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法。篩選到一條適用于特異性檢測(cè)的探針。