基于殼聚糖的納米載體系統(tǒng)的構(gòu)建及其腫瘤靶向性研究.pdf

1、癌癥在當今社會已經(jīng)成為人類健康的頭號殺手之一,其治療的關鍵在于靶向性。利用納米技術(shù)結(jié)合受體一配體介導的腫瘤主動靶向技術(shù),以天然無毒可降解的生物材料為載體材料用于包載抗癌藥物,是一種治療癌癥的有效途徑。
　　利用惡性腫瘤細胞較正常細胞過度表達葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白l(GLUTl)的特點,將其配體葡萄糖以丁二酸為連接臂共價連接在水溶性殼聚糖(wsc)分子鏈上,得到新型殼聚糖衍生物,胺糖化殼聚糖(GSC)。紅外、核磁檢測證實了2-(3-羧基-1

2、-丙酰氨基)-2-脫氧-D-葡萄糖(GS)側(cè)鏈成功連接在殼聚糖上,元素分析結(jié)果表明GSC的側(cè)鏈取代度為9.27％。熱重分析結(jié)果表明側(cè)鏈的引入,破壞了殼聚糖分子的剛性結(jié)構(gòu),削弱了分子內(nèi)和分子間的作用力,使得GSC的熱穩(wěn)定性比WSC差。通過芘熒光探針法測定OSC的臨界聚集濃度為O.021 mg/ml,說明在高于此濃度下,GSC溶液中有穩(wěn)定的疏水微區(qū)形成。以FITC為熒光標記,共價修飾在多糖主鏈上,不僅可以對該載體材料定位示蹤,其疏水基團還有

3、利于包載疏水性藥物分子。根據(jù)FWSC和FGSC溶液的熒光強度計算得兩種熒光材料的熒光標記效率分別為1.39％和1.23％。
　　利用離子交聯(lián)法制備了WSC納米粒(WSC NPs),zeta電位和平均粒徑分別為11.5 mV和185.5 nm;利用超聲自組裝法分別制備了GSC納米粒(GSCNPs)、FWSC納米粒(FWSC NPs)和FGSC納米粒(FGSC NPs),zeta電位依次為23.9 mV,25.8 mV和19.5 mV

4、,平均粒徑依次為89.3 nm、92.9 nm和100.8nm。透射電鏡觀察WSC NPs和GSC NPs均為完整的球形,其中自組裝法制得的GSC NPs大小均一,分散均勻;相比較而言,離子交聯(lián)法制得的WSC NPs大小差異較大,粒徑分布較寬,粒子間有團聚現(xiàn)象。紅細胞溶血實驗表明,WSCNPs和GSC NPs的溶血率均小于5％,符合生物醫(yī)用材料對溶血率的要求。蛋白吸附實驗結(jié)果表明WSC NPs和GSC NPs對牛血清蛋白(BSA)均有較

5、低水平的非特異性蛋白吸附,結(jié)合溶血實驗共同證明了兩種納米粒均具有較好的血液相容性。MTT法檢測了新型載體材料GSC NPs和FGSC NPs的細胞毒性,結(jié)果表明兩種納米粒對胎鼠成纖維細胞(MEF)、小鼠乳腺癌細胞(4Tl)和人乳腺癌細胞(MCF-7)在檢測范圍內(nèi)的細胞成活率均大于70％,均未表現(xiàn)出細胞毒性。
　　選用脂溶性抗癌藥物阿霉素(DOX)作為模型藥物,通過超聲結(jié)合透析法制備了DOX-FWSC納米粒(DOX-FWSC NPs

6、)和DOX-FGSC納米粒(DOX-FGSCNPs),zeta電位分別為23 mV和15.6 mV;平均粒徑分別為136.6m和153.1nm;載藥量分別為12.53％和20.1％;包封率分別為40.37％和64.8％。利用透析法研究了兩種載藥納米粒的釋藥動力學:在pH7.4釋藥介質(zhì)中,前7小時釋放速率較快,有明顯的突釋現(xiàn)象;隨后進入緩釋階段,47 h內(nèi)DOX-FWSC NPs和DOX-FGSC NPs的累積釋藥量分別為37％和32％;

7、當改變釋藥介質(zhì)的pH至4.9后,原本達到釋藥平衡的載藥納米粒又在7小時內(nèi)出現(xiàn)明顯的突釋現(xiàn)象,在隨后的64 h繼續(xù)緩釋,118 h內(nèi)DOX-FWSC NPs和DOX-FGSC NPs的累積釋藥量分別為92％和85％,結(jié)果說明所制備的兩種載藥納米粒均具有較好的緩控釋性能。
　　利用MEF,MCF-7和4T1三種細胞對FWSC Nps和FGSC NPs的攝取率做了定量測定,結(jié)果表明相同實驗條件下,FGSC NPs的細胞吞噬率均高于FWS

8、CNPs,可以推斷FGSC NPs的細胞吞噬不僅依賴于粒子表面與細胞膜之間的靜電作用,同樣受益于靶向基團的修飾,使得三種模型細胞均對其有較高的細胞攝取率。以4T1為細胞模型,考察了DOX-FWSC NPs,DOX-FGSC NPs和臨床用藥一鹽酸阿霉素(ADR)對細胞的生長抑制效果,結(jié)果顯示三種測試樣品對細胞的生長抑制均隨藥物濃度的增大而提高,當藥物濃度為2μg/ml時,三種材料對細胞的生長抑制作用由強到弱依次是:DOX-FGSC NP

9、s>ADR>DOX-FWSCNPs,說明DOX-FGSC NPs在低藥物濃度時比ADR具有更好的腫瘤細胞生長抑制作用,該結(jié)論與熒光顯微鏡觀察到的結(jié)果相一致。體外細胞實驗結(jié)果初步判斷由GSC制備的納米載體利于細胞吞噬,具有腫瘤細胞靶向性。
　　建立小鼠乳腺癌動物模型,分別檢測ADR,DOX-FWSC NPs與DOX-FGSCNPs對荷瘤小鼠的體內(nèi)抗腫瘤作用,通過測量小鼠的腫瘤體積、體重、各組織中的藥物分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOX-FGSC

10、NPs具有較好的抑瘤效果且對機體均無明顯毒副作用,不僅得益于其親水外殼和較小的粒徑使之被動靶向蓄積于腫瘤組織,還得益于其靶向基團的修飾,使其能利用受體一配體介導的主動靶向作用,蓄積于腫瘤組織的同時減小藥物在其他器官中的蓄積。雙抗體一步夾心法測定了荷瘤小鼠各組織器官中的GLUTl表達水平,對照相應組織中的藥物含量,進一步證實DOX-FGSC NPs對腫瘤組織的主動靶向性依賴于它對GLTl的主動靶向性。
　　本論文以水溶性殼聚糖為基礎