ICOSL-ICOS信號通路介導(dǎo)Th17極化與血吸蟲卵肉芽腫免疫應(yīng)答及肝纖維化形成的分子機(jī)制.pdf

1、血吸蟲病的發(fā)病機(jī)制主要是蟲卵引發(fā)的宿主的肝臟和腸等臟器組織產(chǎn)生肉芽腫病變，并繼發(fā)纖維化。其實質(zhì)是由于CD4+T淋巴細(xì)胞持續(xù)對蟲卵抗原發(fā)生免疫應(yīng)答。研究表明，Th1/Th2免疫偏移與血吸蟲病蟲卵肉芽腫的發(fā)生、發(fā)展及免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)。Th17和Tfh是近年來備受關(guān)注的兩個新T細(xì)胞亞群。已有研究證實ICOSL/ICOS信號在血吸蟲導(dǎo)致的慢性炎癥及纖維化形成過程中有重要作用。最新研究表明，ICOS的表達(dá)與Th17的產(chǎn)生直接相關(guān)，亦與Tfh功

2、能密切相關(guān)。本課題應(yīng)用ICOS轉(zhuǎn)基因及ICOSL敲基因小鼠作為血吸蟲病實驗動物模型，結(jié)合體內(nèi)外實驗共同闡明Th17細(xì)胞介導(dǎo)的血吸蟲卵肉芽腫以及肝纖維化形成的分子機(jī)制，并初步探討ICOSL/ICOS信號對Tfh極化的影響，探索以ICOSL/ICOS信號通路為靶點(diǎn)調(diào)節(jié)Th17及Tfh極化，下調(diào)或控制蟲卵肉芽腫反應(yīng)，抑制或防止肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展，尋找控制血吸蟲性肝纖維化的新途徑。本研究分為五個部分：
　　第一部分：ICOSL-KO/I

3、COS-Tg小鼠感染日本血吸蟲病程中Th17極化相關(guān)分子的動態(tài)變化。
　　目的：探討ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲后，ICOSL/ICOS信號的增強(qiáng)或減弱對與Th17極化相關(guān)的共刺激分子、轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響。
　　方法：在日本血吸蟲感染前（0周）和感染早期階段（4周）、急性病變期(7周)、慢性期（12周）、晚期（16周）應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠及其野生型對照小鼠

4、CD4+T淋巴細(xì)胞上ICOS、CD154、IL-17A、RORγt和CD19+B淋巴細(xì)胞上ICOSL、CD40、IL-17R的表達(dá)水平。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測同期ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠及其野生型對照小鼠肝組織IL-17A的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:感染日本血吸蟲后野生型小鼠脾CD4+T淋巴細(xì)胞上ICOS、CD154以及脾CD19+B淋巴細(xì)胞上CD40的表達(dá)水平從感染4周后升高，感染12周后達(dá)到峰

5、值，隨后緩慢下降。ICOSL-KO小鼠脾CD4+T淋巴細(xì)胞上ICOS、CD154的表達(dá)與同期野生型小鼠相比顯著下調(diào)，ICOS的表達(dá)在感染4周后各病期均顯著下調(diào)。CD154在感染12周后顯著下調(diào)。由于ICOSL敲除，在血吸蟲感染后各病期CD19+B淋巴細(xì)胞上ICOSL的表達(dá)都極低。同時，Th17特異性的轉(zhuǎn)錄因子RORγt以及其重要的作用因子IL-17A在ICOSL-KO小鼠的脾CD4+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)均顯著下調(diào);ICOS-Tg小鼠的檢測

6、結(jié)果則恰好相反。免疫組織化學(xué)法檢測IL-17A在肝組織的表達(dá)水平的結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果一致。
　　結(jié)論：ICOSL/ICOS信號的缺失可導(dǎo)致Th17亞群數(shù)量及功能的抑制;而加強(qiáng)該信號則誘導(dǎo)免疫應(yīng)答向Th17偏移。
　　第二部分：日本血吸蟲感染ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠致病過程中ICOSL/ICOS信號對Th17極化的影響
　　目的：探討ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲后， ICOSL/IC

7、OS信號缺失或增強(qiáng)對Th17極化的影響。
　　方法：收集感染前（0周）和感染后4周、7周、12周、16周、20周的小鼠脾淋巴細(xì)胞，與SEA共培養(yǎng)，誘導(dǎo)72小時后收集培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中Th17型細(xì)胞因子IL-17、IL-23、IL-6; Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13、TGF-β1;Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-12。
　　結(jié)果：Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ在ICOSL-KO小

8、鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的表達(dá)水平與其野生型對照相比呈顯著上調(diào);Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13、TGF-β1與其野生型對照相比表達(dá)則呈顯著下調(diào);Th17型細(xì)胞因子IL-17、IL-6、IL-23與其野生型對照相比表達(dá)亦呈顯著下調(diào)。而ICOS-Tg小鼠與其野生型對照相比，其脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1細(xì)胞因子IFN-γ呈顯著下調(diào);Th2細(xì)胞因子IL-13、IL-4則呈顯著上調(diào);Th17細(xì)胞因子IL-17亦呈顯著上調(diào)。
　　結(jié)論：進(jìn)

9、一步證實了感染日本血吸蟲后隨著病程由急性期轉(zhuǎn)為慢性期，宿主的免疫應(yīng)答由Th1型逐漸向Th2型轉(zhuǎn)化;同時，也提示，伴隨著蟲卵肉芽腫形成，下調(diào)ICOSL/ICOS信號可導(dǎo)致Th2/Th17免疫應(yīng)答的減弱，該信號在介導(dǎo)日本血吸蟲感染宿主引發(fā)的免疫應(yīng)答中對Th2/Th17極化的免疫效應(yīng)可能起到重要作用。
　　第三部分：ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲ICOSL/ICOS信號介導(dǎo)肝蟲卵肉芽腫免疫應(yīng)答及肝纖維化形成中的作用。

10、
　　目的：探討日本血吸蟲感染ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠后，ICOSL/ICOS信號缺失或增強(qiáng)對小鼠肝蟲卵肉芽腫病變及繼發(fā)性纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響。
　　方法：觀察ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲后肝脾病變及重量的改變;運(yùn)用HE染色法觀察肝臟蟲卵肉芽腫病變在ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠中的動態(tài)變化;Kaplan-Meier生存分析觀察ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲后的生

11、存率。運(yùn)用Masson染色法觀察肝臟纖維化程度在ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠中的變化;應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠肝組織中IL-13、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)水平動態(tài)變化。
　　結(jié)果：免疫組化檢測顯示，ICOS-Tg小鼠肝組織內(nèi)均可見明顯TGF-β1、IL-13陽性反應(yīng)，呈片狀分布于蟲卵肉芽腫內(nèi)及其周圍匯管區(qū)、肝血竇，與其野生型對照相比，ICOS-Tg小鼠肝組織TGF-β1

12、、IL-13表達(dá)水平顯著增強(qiáng);ICOSL-KO小鼠肝組織內(nèi)TGF-β1、IL-13陽性反應(yīng)較少，與其野生型對照相比，TGF-β1、IL-13表達(dá)水平顯著下降。ICOS-Tg小鼠肝組織內(nèi)MMP-9、TIMP-1陽性反應(yīng)呈棕黃色，表達(dá)于竇周、匯管區(qū)、蟲卵肉芽腫纖維組織內(nèi)，與其野生型對照相比，MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平顯著增強(qiáng);ICOSL-KO組MMP-9、TIMP-1陽性反應(yīng)較少，與其野生型對照相比，MMP-9、TIMP1表達(dá)水平顯著

13、減弱。另外，ICOS-Tg小鼠肝脾腫大明顯，肉芽腫體積增大，纖維化程度更為嚴(yán)重，生存率顯著下降;而ICOSL-KO小鼠則均與ICOS-Tg的表現(xiàn)相反。
　　結(jié)論：ICOSL/ICOS信號參與了日本血吸蟲感染宿主慢性致病過程的病理反應(yīng);ICOSL/ICOS信號的減弱或缺失可使血吸蟲性肝纖維化進(jìn)程得到一定程度的抑制。該信號介導(dǎo)的Th2/Th17極化反應(yīng)與肝蟲卵肉芽腫反應(yīng)和繼發(fā)性纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
　　第四部分：體外干預(yù)

14、ICOSL/ICOS信號通路對日本血吸蟲感染小鼠Th亞群極化的影響。
　　目的：探究日本血吸蟲感染ICOS-Tg小鼠后，ICOSL/ICOS信號通路對Th17極化的影響及體外干預(yù)ICOSL/ICOS信號通路對Th17極化的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：收集感染前（0周）和感染后4周、7周、12周、16周、20周的小鼠脾淋巴細(xì)胞，與SEA共培養(yǎng)，并運(yùn)用ICOS單抗阻斷ICOSL/ICOS信號通路，收集培養(yǎng)上清，應(yīng)用CBA技術(shù)（流式細(xì)胞

15、儀的液相蛋白定量技術(shù)）檢測Th1、Th2、Th17型細(xì)胞因子。
　　結(jié)果：與野生型小鼠相比，ICOS-Tg小鼠產(chǎn)生較高水平的IL-17、IL-4和較低水平的IFN-γ。運(yùn)用阻斷性單抗阻斷ICOSL后，ICOS-Tg小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ呈顯著上調(diào);Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-13均顯著下調(diào)，Th17型細(xì)胞因子IL-17亦顯著下調(diào);阻斷ICOS，也發(fā)生上述現(xiàn)象。
　　結(jié)論：干預(yù)ICO

16、SL/ICOS信號能顯著降低Th2/Th17型細(xì)胞因子的表達(dá)，調(diào)控免疫偏移的方向。
　　第五部分：ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲病程中ICOSL/ICOS信號對Tfh極化的影響。
　　目的：探究日本血吸蟲感染ICOS-Tg小鼠后，ICOSL/ICOS信號增強(qiáng)對與Tfh極化相關(guān)的共刺激分子、轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響。
　　方法：感染日本血吸蟲前（0周）和感染后的早期（4周）、急性病變期（7周）、慢性期（12周）

17、、晚期（16周）的ICOS-Tg小鼠及其野生型對照小鼠的CD4+T淋巴細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測其CXCR5、BCL-6的表達(dá)及CXCR5+IL-21+細(xì)胞群和CXCR5+CD4+細(xì)胞上ICOS、CD40L的表達(dá)水平。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測同期ICOS-Tg小鼠及其野生型對照小鼠肝組織CXCR5、BCL-6的表達(dá)水平。脾淋巴細(xì)胞用SEA進(jìn)行誘導(dǎo)72小時后收集上清，運(yùn)用阻斷性單抗阻斷ICOSL/ICOS信號后檢測IL-21的表達(dá)。
　　

18、結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示日本血吸蟲感染后野生型小鼠脾CD4+T淋巴細(xì)胞CXCR5、BCL-6、CXCR5+IL-21+細(xì)胞群的表達(dá)水平以及CXCR5+CD4+T淋巴細(xì)胞群上ICOS、CD40L的表達(dá)水平從感染4周后升高，感染12周后出現(xiàn)表達(dá)水平的峰值，然后緩慢的下降。以上檢測指標(biāo)在ICOS-Tg小鼠中的表達(dá)水平與其野生型對照小鼠相比均顯著上調(diào)。免疫組織化學(xué)法檢測CXCR5和BCL-6在肝蟲卵肉芽腫周圍的表達(dá)水平的結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)