生長抑素對(duì)前列腺癌蛋白表達(dá)特性的影響.pdf

1、研究背景：前列腺癌在美國是最常見的實(shí)體惡性腫瘤。2005年約有23.2萬前列腺癌新病例并有近3萬前列腺癌病人死亡。通常在亞洲尤其在中國的前列腺癌發(fā)病率最低，但近年發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。局限性或轉(zhuǎn)移性的前列腺癌標(biāo)準(zhǔn)的初始治療是雄激素去勢(shì)治療(Androgen Deprivation Therapy,ADT)，可采用雙側(cè)睪丸切除或促黃體生成素釋放激素(Luteinizing Hormone-Releasing Hormone，LHRH)治療

2、。轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者對(duì)于雄激素依賴(Androgen Dependence)通常約14-30個(gè)月，然后進(jìn)展為對(duì)雄激素非依賴性狀態(tài)(Aaadrogen-IndependenceProstate Cancer，AIPC)。在此期間，盡管雄激素維持在去勢(shì)水平，但對(duì)ADH治療無效。部分病人對(duì)二次激素治療仍有反應(yīng)，隨后即失去對(duì)激素的反應(yīng)性，進(jìn)入激素難治性(Hormone Refractory Prostate Cancer,HRPC)狀態(tài)。處于A

3、IPC和HRPC狀態(tài)的患者可以有各種不同的表現(xiàn)，如前列腺特異性抗原(Prostatic SpecificAntigen，PSA)升高，伴隨或者不伴隨轉(zhuǎn)移，影像學(xué)改變，包括骨掃描或軟組織浸潤以及加重的臨床癥狀，如疼痛加劇，排尿梗阻加重。 前列腺癌激素轉(zhuǎn)化的分子生物學(xué)機(jī)制尚不完全明了。前列腺癌激素非依賴性表型的獲得是前列腺癌治療的最嚴(yán)重的問題。盡管已有數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂捎脕磉M(jìn)行激素依賴性研究，但其在激素非依賴性研究中的應(yīng)用受限。LNCa

4、P是一個(gè)人前列腺癌細(xì)胞系，常常被用來進(jìn)行各種體外實(shí)驗(yàn)。該細(xì)胞系是自前列腺癌轉(zhuǎn)移的鎖骨上淋巴結(jié)分離而來，表達(dá)雄激素受體(Androgen Receptor,AR)，呈現(xiàn)對(duì)雄激素敏感的生長狀態(tài)。盡管在培養(yǎng)液中雄激素的活性水平與生理狀態(tài)相當(dāng)，但隨著的LNCaP傳代，它的生長將逐漸失去對(duì)雄激素的依賴性，很好地模擬前列腺癌臨床進(jìn)展過程，是一個(gè)非常理想的前列腺癌實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。近年來發(fā)現(xiàn)，生長抑素(Somatostatin,sms)以及其類似物能夠通過數(shù)

5、種調(diào)節(jié)機(jī)制來抑制前列腺癌的生長，通過抑制生長激素、胰島素等分泌，通過與生長抑素受體1-5(somatostatin receptor,sstr)的結(jié)合，抑制細(xì)胞的有絲分裂，從而抑制細(xì)胞的生長。激素非依賴性前列腺癌表達(dá)sstr受體。sms類似物，如奧曲肽(Octreotide)目前僅有少量臨床實(shí)驗(yàn)，且僅表現(xiàn)出有限的作用。HRPC主要表達(dá)sstr1受體，而奧曲肽僅作用于sstr2和sstr5，這也是為什么奧曲肽在前列腺癌的治療中受限的可能原

6、因。生長抑素類似物與sstr1的高度親和性成為治療HRPC的一個(gè)有效的選擇。最近我們報(bào)道了一種新的奧曲肽類似物(smsdx)，具有和sstr1-5受體廣泛的親和性，這種新藥物是基于天然生長抑素(sms14)而開發(fā)的。體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示生長抑素類似物能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的生長。應(yīng)用前列腺癌細(xì)胞系LNCaP的實(shí)驗(yàn)也提示生長抑素對(duì)LNCaP的細(xì)胞增殖和蛋白分泌有抑制作用，該作用是通過激活蛋白酶phosphotyrosyl protein

7、phosphatases實(shí)現(xiàn)的。 在后基因組時(shí)代，生物學(xué)的中心任務(wù)是認(rèn)識(shí)基因組的功能。由于基因功能主要是通過其表達(dá)蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的，要了解基因的全部信息，必須深入研究不同基因編碼的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)研究中已具有重要的地位。腫瘤蛋白組學(xué)(Oncoproteomics)是應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)研究腫瘤細(xì)胞中的蛋白以及其相互關(guān)系到學(xué)科。腫瘤細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)樣本通常經(jīng)過雙向電泳等技術(shù)可以按不同大小分子量、等電點(diǎn)或類型得以分離(Pr

8、ofiling)，然后通過質(zhì)譜技術(shù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比較，進(jìn)一步將特殊的感興趣的蛋白質(zhì)鑒定出來。腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)是整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，通過蛋白質(zhì)組分析技術(shù)將能夠從細(xì)胞整體水平上認(rèn)識(shí)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中蛋白表達(dá)譜的變化，為尋找特異的腫瘤標(biāo)志物這一研究領(lǐng)域帶來了新的希望。腫瘤蛋白組學(xué)有可能為臨床實(shí)踐帶來根本性的改革,包括腫瘤診斷、基于蛋白組學(xué)平臺(tái)的作為組織病理學(xué)補(bǔ)充的腫瘤篩選、個(gè)性化治療方案組合的選擇、腫瘤特異性蛋白靶目標(biāo)的確

9、定、實(shí)時(shí)評(píng)估治療效果和藥物毒性、依據(jù)與腫瘤預(yù)后及耐藥相關(guān)的腫瘤蛋白調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)合理地調(diào)節(jié)治療方案。 材料和方法：為了了解和闡明sms以及smsdx的分子水平作用機(jī)制，我們采用蛋白組學(xué)分析方法進(jìn)行研究。首先用sms以及smsdx處理LNCaP細(xì)胞，1nM3天。然后按照標(biāo)準(zhǔn)的雙相凝膠(2-Dimansional Electrophoresis,2-DE)電泳方法進(jìn)行蛋白的提取，濃度測(cè)定，蛋白裂解。固定膠條(Immobilized pH

10、Gradients,IPG)的使用，不僅提高了胞內(nèi)蛋白的分離效率，而且增加了雙相電泳的可重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)采用11cm的IPG strip(pH3-10)進(jìn)行一相蛋白分離，應(yīng)用12.5％的Tris-HCI成品膠根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行雙相蛋白的分離，采用敏感的銀染方法(SilverStaining)進(jìn)行染色，掃描圖像，用PDQuest軟件系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，采用T-studentTest和Mann-Whitney進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，找出差異表達(dá)的蛋

11、白，以sms處理組作為陽性對(duì)照，未用藥物處理組作為陰性對(duì)照，來確定sms和smsdx對(duì)前列腺癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的差異性和共同性。然后采用基質(zhì)激光輔助的解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry.MALDI-TOF-MS)分析方法，對(duì)受影響的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析，通過與資料庫的對(duì)照研究，確定相關(guān)蛋白，從而來確定前

12、列腺癌激素依賴性轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)蛋白以及可能的調(diào)節(jié)途徑。 結(jié)果： 1.在用1nM sms和smsdx處理前列腺癌細(xì)胞系LNCaP 3天以后，掃描獲取銀染的凝膠圖像，應(yīng)用PDQuest軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。首先檢測(cè)3組膠以及每組膠成員之間的相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient)位于0.85-0.92之間，顯示出高度的可重復(fù)性。3個(gè)樣本組(陰性對(duì)照組，sms陽性對(duì)照組以及smsdx處理組)顯示出對(duì)蛋白影響的共同性和

13、差異性。在smsdx處理組中，與陽性對(duì)照組(sms處理組)比較，我們發(fā)現(xiàn)有63個(gè)蛋白點(diǎn)上調(diào)表達(dá)(高于2倍)(P值小于0.05)。在smsdx處理組中，與陰性對(duì)照組比較，我們發(fā)現(xiàn)有489個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)表達(dá)(高于2倍)。在sms處理組中，44個(gè)蛋白點(diǎn)上調(diào)表達(dá)(高于2倍)(P值小于0,05)，有386個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)表達(dá)(高于2倍)。在上調(diào)表達(dá)的63個(gè)蛋白點(diǎn)中，有24個(gè)蛋白點(diǎn)受sms和smsdx共同上調(diào)表達(dá)(高于2倍)，約占33,33％。受sms和

14、smsdx影響，有295個(gè)蛋白點(diǎn)共同下調(diào)表達(dá)(高于2倍)。 2.本實(shí)驗(yàn)有三個(gè)組，陰性對(duì)照組，陽性對(duì)照組(sms組)，smsdx處理組。通過PDQuest軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，應(yīng)用Mann-Whitney方法檢測(cè)，采用MALDI-TOF-MS/MS方法有172個(gè)蛋白點(diǎn)(protein spot)得到分析，共鑒定出140種蛋白質(zhì)。這是由于蛋白質(zhì)的同構(gòu)異功體的存在所致。參照蛋白基因信息資料庫Swiss-Prot，Genome Brower

15、以及National Center for Biotechnology Information(NCBI)等進(jìn)行生物信息分析，按照這些蛋白已知的生化功能，如代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維護(hù)、細(xì)胞間反應(yīng)、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等對(duì)鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體及線粒體相關(guān)蛋白明顯受sms和smsdx的影響，大部分出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)(高于2倍)。與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白則出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)(如VDAC1，VDAC2)，有出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)(如PR

16、DX2,TCTP)。PRDX2蛋白的表達(dá)變化高于2倍，而其他蛋白則低于2倍。sms和smsdx引發(fā)的線粒體蛋白的上調(diào)似乎也影響到細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。 3.在前列腺癌種蛋白在前列腺癌激素依賴性細(xì)胞系LNCaP的培養(yǎng)過程中，對(duì)細(xì)胞系行逐漸的去激素化培養(yǎng)，我們最終建立了對(duì)激素非依賴性細(xì)胞系LNCaP-s?；谖覀兘⒌牧邢侔┘に匾蕾囆约?xì)胞系LNCaP蛋白資料庫，共鑒定出22種線粒體蛋白和22種腫瘤相關(guān)蛋白。通過文獻(xiàn)檢索和查尋蛋白信

17、息庫，發(fā)現(xiàn)16種蛋白可作為與腫瘤相關(guān)的候選標(biāo)記物。其中11種蛋白在前列腺癌激素依賴性細(xì)胞系LNCaP中與激素非依賴性細(xì)胞系中有明顯的差異性表達(dá)。 結(jié)論： 1.生長抑素類似物(smsdx)在對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響上具有與生長抑素類似的作用。該研究結(jié)果顯示出生長抑素類似物的效果和細(xì)胞在分子水平的反應(yīng)。蛋白組學(xué)技術(shù)是一種可靠的能夠鑒定出各種多肽的先進(jìn)手段，為臨床上腫瘤標(biāo)記物的鑒定提供了可靠的保證。 2.生長抑素以及生長抑

18、素類似物(smsdx)，能夠共同調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞系LNCaP中的重要蛋白，表現(xiàn)出相似的作用機(jī)制和影響程度。鑒定出的線粒體及線粒體相關(guān)蛋白，在細(xì)胞凋亡過程中起著非常重要的作用。出現(xiàn)差異表達(dá)的相關(guān)腫瘤蛋白的鑒定，為篩選可靠的腫瘤標(biāo)記物以及治療靶蛋白提供了有效的信息。 3.本課題組通過去激素化培養(yǎng)前列腺癌激素依賴性細(xì)胞系LNCaP，得到的對(duì)激素非依賴性細(xì)胞系LNCaP-s，為我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和了解臨床前列腺癌激素依賴性轉(zhuǎn)化的機(jī)制提供了一