溶血磷脂酸受體在人食管下括約肌的表達及功能研究.pdf

1、食管胃結合部(Esophagogastric junction，EGJ)是一個復雜的瓣膜結構，其主要是由食管下括約肌(Lower esophageal sphincter, LES)和膈肌腳組成的高壓帶。LES是大約2-3厘米的增厚的環(huán)形肌肉束，并在1979年由Liebermann-Meffert第一次提出來的，其是由胃小彎側半環(huán)形的鉤狀纖維和胃大彎側的斜行的套索纖維共同構成的。在非吞咽時防止胃內(nèi)容物反流，而在吞咽過程中保持開放并促進食

2、管或胃內(nèi)容物向下流動。
　　LES發(fā)生的收縮和舒張反應的調(diào)節(jié)機制是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的支配下，由其自身肌源性因素、多種激素和神經(jīng)遞質(zhì)參與而共同完成的。LES的收縮和舒張是由迷走神經(jīng)節(jié)前纖維和交感神經(jīng)節(jié)后纖維支配的。迷走神經(jīng)節(jié)前纖維不僅可以通過肌間神經(jīng)叢并且也可以通過抑制性神經(jīng)通路和興奮性神經(jīng)通路來完成對LES的舒張和收縮功能的支配。其抑制性和興奮性節(jié)前細胞分別位于迷走神經(jīng)背側運動核的尾部和前部。典型的是，膽堿能神經(jīng)元是迷走神經(jīng)節(jié)前纖維

3、通過煙堿和毒蕈堿受體發(fā)揮其對肌間神經(jīng)叢的抑制作用。興奮性和抑制性神經(jīng)元通路通過影響肌源性張力來影響LES張力。興奮性肌間神經(jīng)元通過釋放乙酰膽堿和P物質(zhì)增加LES張力。而抑制性肌間神經(jīng)元是通過產(chǎn)生NO來減少LES的張力，NO是最主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在吞咽時引起的LES舒張。支配LES的交感傳出神經(jīng)起源于脊髓節(jié)段T6-T10。內(nèi)臟節(jié)前纖維屬于膽堿能神經(jīng)元，它是以腹腔神經(jīng)節(jié)為靶標激活去甲腎上腺素能節(jié)后神經(jīng)元直接支配LES平滑肌，或與腸道運動

4、神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系來完成對LES的支配。
　　溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)是由血小板釋放并存在于血清中的一種生物活性的脂質(zhì)介體。它已經(jīng)被確定是一種有效的并具有細胞增殖、存活和遷移、促進傷口愈合、血小板聚集、血管重塑、軸突回縮、分化抑制/逆轉、膜去極化、形成粘著斑和應力纖維、血壓調(diào)節(jié)和平滑肌收縮等多種生物學作用的磷脂信使。LPA具有其功能主要是通過結合其特定的G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-c

5、oupled receptors，GPCRs）而實現(xiàn)的。目前為止，一共有六個GPCRs被確定為特殊的LPA受體，它們是LPA1-6，其中LPA1-3被確定為內(nèi)皮分化基因的GPCRS(Endothelial differentiationgene，EDG)亞家族的成員，因為它們彼此擁有很高的同源性。與此相反的，LPA4-6同LPA1-3同源性相差較大，它們屬于非EDG家族成員。
　　大量研究表明，食管運動功能障礙性疾病如胡桃夾食管、

6、賁門失弛緩癥以及彌漫性食管痙攣等疾病中均與LES或/和食管肌層的功能異常相關。目前國內(nèi)外的研究表明對于LES的調(diào)節(jié)機制主要涉及多種受體及其信號傳導通路和多種神經(jīng)遞質(zhì)都發(fā)揮著重要的作用。
　　本研究采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)，蛋白印跡法(Western-blot)，離體肌張力測定技術以及電場刺激(Electrical field stimulation，EFS)等方法對LPA受體在人LE

7、S中的表達及功能進行研究。探討了LPA受體在人LES調(diào)節(jié)機制中的作用，為進一步研究LPA及其受體在人LES調(diào)節(jié)機制中的作用奠定基礎，從而更為完善的闡述人LES調(diào)節(jié)機制，為治療食管運動功能障礙性疾病提供依據(jù)。
　　第一部分溶血磷脂酸受體在人食管下括約肌的表達規(guī)律
　　目的:LPA受體是G蛋白偶聯(lián)受體家族重要的受體之一。本實驗采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，實時定量聚合酶鏈反應(qP CR)和蛋白印跡法(Western-

8、blot)研究人食管下括約肌中的LPA受體六種亞型在鉤狀纖維、套索纖維、食管環(huán)形肌和胃底環(huán)形肌中的表達規(guī)律。
　　方法:選取河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院自2012年1月到2012年7月因高位食管癌行食管大部切除術的患者總共15例，其中男性患者9例，女性患者6例，平均年齡約為64歲。在手術室收集新鮮的食管胃結合部標本，制備套索纖維、鉤狀纖維、胃底環(huán)形肌和食管環(huán)形肌肌條。提取各個組織總RNA，在確定它的純度和它的完整性之后，分別應用6種溶血磷

9、脂酸亞型的引物行RT-PCR，確定其mRNA在4種肌條的表達之后，在進行實時定量PCR確定其相對含量大小。提取各個組織總蛋白，將蛋白調(diào)整至相同的濃度，經(jīng)電泳分離出LPA受體的各個亞型后轉膜，隨后分別應用LPA受體的各個亞型抗體進行孵育過夜，經(jīng)Gel Pro軟件分析各受體反應條帶的光密度值(IOD)。
　　結果:紫外分光光度計測定顯示，總RNA A260/A280比值約為1.8-2.0。六種LPA受體亞型的mRNA在各個肌條均有表達

10、:分別是LPA1R、LPA2R、LPA3R、LPA4R、LPA5R和LPA6R。其擴增產(chǎn)物的長度與我們設計的長度是一致的。在同一種肌條中而不同的LPAR亞型的mRNA的表達水平的比較是有統(tǒng)計學差異的(F=61.034，P=0.000)，它們的表達水平的強度依次為LPA1R＞LPA6R＞LPA4R=LPA2R=LPA5R=LPA3R。同一種LPA受體亞型的mRNA的表達水平在不同種肌條之間的比較沒有統(tǒng)計學差異(F=0.201，P=0.89

11、5)。全部的LPA的受體亞型的總蛋白在四種肌條內(nèi)也全部可以見其表達，分別是LPA1R、LPA2R、LPA3R、LPA4R、LPA5R和LPA6R。它們的分子量大小分別為39KD、40KD、42KD、42KD41 KD和39KD。在同一種肌條內(nèi)不同的LPAR亞型的總蛋白的表達的比較也是有統(tǒng)計學差異(F=1224.659，P=0.000)，它們的蛋白表達水平的強弱和其mRNA的表達水平的結果是一致的。同一LPA受體亞型的蛋白表達水平在各個肌

12、條間的比較是沒有統(tǒng)計學差異的(F=0.039，P=0.990)。
　　結論:人LES中存在著六種LPA受體亞型，分別是LPA1R、LPA2R、LPA3R、LPA4R、LPA5R和LPA6R。它們的表達水平依次是LPA1R＞LPA6R＞LPA4R=LPA2R=LPA5R=LPA3R。它們可能在人LES的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。
　　第二部分溶血磷脂酸受體在人食管下括約肌調(diào)節(jié)機制中的功能研究
　　目的:研究非選擇性的LP

13、A受體的激動劑以及選擇性的LPA受體的激動劑對人離體LES的鉤狀纖維(clasp)、套索纖維(sling)的作用，探討LPA受體在人LES收縮和舒張的調(diào)節(jié)機制中所發(fā)揮的的作用。
　　方法:選取河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院自2012年7月到2013年3月因高位食管癌行食管大部切除術的患者總共30例，其中男性患者19例，女性患者11例，平均年齡約為62歲。在手術室采集新鮮的食管胃結合部標本隨后立即放入4℃的Krebs中，沖洗干凈后將標本粘膜面

14、向上固定在盛有Krebs液體的蠟盤內(nèi)，保持含5％ CO2和95％O2混合的氣體持續(xù)通過。從標本的胃大彎側切開，銳性剝離其賁門部和食管下段的粘膜層及粘膜下層，可見位于食管胃交界處的發(fā)白增厚的肌肉層即為食管下括約肌，肉眼識別出套索纖維與鉤狀纖維的位置。其套索纖維位于食管胃結合處的兩端并呈斜行分布，而鉤狀纖維則位于食管胃結合處的中央并呈半環(huán)形。沿走形方向充分游離鉤狀纖維和套索纖維，并將其制備成(2～4) mm×(8～12) mm的朋條。分別用

15、絲線將其肌條的兩端扎緊，并置于含Krebs液10毫升保持37℃恒溫的浴槽中，并持續(xù)通過其含有5％ CO2和95％O2的氣體。將肌條上端與JZ101型肌肉張力換能器固定在一起，應用Medlab信號采集器記錄各個肌條的張力變化情況。緩慢輕柔的牽拉肌條使之張力達到200mg，此時的肌條長度即為初始長度L0，然后多次緩慢牽拉肌條，每次牽拉的長度約為增加初始長度的25％左右，待其穩(wěn)定后再次牽拉直至肌條長度被拉伸到初長度的200％作為其最適初長度。

16、待肌條的最適初長度穩(wěn)定大約40分鐘以后，再以濃度累計方式分別向恒溫浴槽中加入非選擇性的LPA受體激動劑來激活LPA受體各個亞型。給藥濃度為(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)。觀察給藥后肌條的張力變化的情況，待其張力穩(wěn)定后可再增加一個濃度，每次加藥前都要等前一個濃度達到其最大反應且穩(wěn)定后加入下一濃度的藥物。待肌條穩(wěn)定10分鐘后再行加藥。據(jù)此建立累計給藥的濃度-反應量效曲線。并計算出加藥后反應的最大效應

17、和其對應的濃度。在觀察拮抗劑的效應時，發(fā)現(xiàn)其拮抗劑的濃度同激動劑誘導肌條產(chǎn)生最大效應的濃度是相同的。選擇性的LPA受體激動劑同選擇性的LPA拮抗劑的加藥方法與之前相同。用肌條收縮或舒張百分比的均數(shù)±標準誤（(x)±SE）來表示藥物誘發(fā)的肌條的反應。
　　結果:
　　1非選擇性LPA受體激動劑和拮抗劑對人LES的作用
　　非選擇性LPA受體激動劑LPA在（10-6、10-5、10-4mol/L）的濃度能夠誘導人LES的套

18、索纖維、鉤狀纖維兩種肌條產(chǎn)生收縮效應。應用非選擇性LPA受體的阻滯劑(Tetradecyl-phosphonate)(10-5mol/L)可以完全抑制LPA(10-5mol/L)所誘導其套索纖維、鉤狀纖維產(chǎn)生的收縮效應。
　　2選擇性的LPA1和LPA2受體激動劑L-α-Lysophosphatidic acid對人LES的作用
　　選擇性的LPA1和LPA2受體激動劑L-α-Lysophosphatidic acid在（1

19、0-6、10-5、10-4mol/L）的濃度下能夠誘導人LES中的套索纖維、鉤狀纖維這這兩種肌條產(chǎn)生濃度依賴性的收縮效應。這兩肌條間的收縮效應比較沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。在10-5 mol/L時，兩肌條均達到最大收縮百分比。鉤狀纖維的最大收縮百分比為（25.3±1.1）％，套索纖維的最大收縮百分比為（23.8±0.9）％。這兩者之間的比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　3選擇性的LPA3受體激動劑OMPT對人LES的作

20、用
　　選擇性的LPA3受體激動劑OMPT在（10-6、10-5、10-4mol/L）的濃度下能夠誘導人LES中的套索纖維、鉤狀纖維這兩種肌條產(chǎn)生濃度依賴性的收縮效應，這兩肌條間的收縮效應比較沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。在10-5 mol/L時，這兩肌條均可達到最大收縮百分比。鉤狀纖維的最大舒張百分比為（7.2±0.4）％，套索纖維的最大舒張百分比為（7.8±0.6）％，這兩者的比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結

21、論:
　　1非選擇性LPA受體激動劑LPA能夠誘導人的LES發(fā)生收縮效應。非選擇性LPA受體的阻滯劑Tetradecyl-phosphonate能夠完全抑制其非選擇性激動劑LPA所誘導的收縮效應。這表明非選擇性激動劑是通過LPA受體來實現(xiàn)其對食管下括約肌的調(diào)節(jié)作用的。
　　2選擇性的LPA1和LPA2受體激動劑L-α-Lysophosphatidic acid能夠誘導人LES中的這兩種肌條發(fā)生濃度依賴性的收縮效應。在10-5

22、 mol/L時，其達到了最大的收縮百分比。這兩肌條間的收縮效應比較沒有統(tǒng)計學差異。提示LPA1受體或LPA2受體，或LPA1和LPA2受體可能參與了食管下括約肌調(diào)節(jié)過程中的收縮反應。
　　3選擇性的LPA3受體激動劑OMPT能夠誘導人LES中的這兩種肌條發(fā)生濃度依賴性的收縮效應，在10-5 mol/L時，其達到了最大收縮百分比。這兩肌條間的收縮效應比較沒有統(tǒng)計學差異。提示LPA3受體可能也參與了食管下括約肌調(diào)節(jié)過程中的收縮反應。<

23、br>　　第三部分溶血磷脂酸受體在電場刺激誘導的人食管下括約肌反應的作用研究
　　目的:研究選擇性LPAR的拮抗劑在電場刺激下對人LES的套索纖維和鉤狀纖維的作用，探討LPAR在人LES神經(jīng)調(diào)節(jié)通路過程中的作用。
　　方法:選取河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院自2013年3月到2013年12月因高位食管癌行食管大部切除術的患者總共20例，其中男性患者13例，女性患者7例，平均年齡約為59歲。套索纖維和鉤狀纖維的制備方法同前面所述。并將制

24、備好的肌條置于含Krebs液10毫升并保持37℃恒溫的浴槽中，并持續(xù)通過其含有5％ CO2和95％O2的氣體。將制備好的肌條的上端與肌肉張力換能器相連，同時下端同帶有鉑金電極的L形固定架固定在一起，應用Medlab信號采集器來記錄各個肌條張力的變化情況。保證各個肌條在兩個環(huán)形、平行的鉑金電極的中間，它們之間的距離應該大于3mm，應用生理藥理多用儀來進行電場刺激。應用上面所述的方法來調(diào)節(jié)肌條長度達到最適初長度。EFS刺激參數(shù):單脈沖方波、

25、波寬5ms、電壓50V、頻率1～512Hz以倍數(shù)遞增。其頻率從小到大行EFS，并計算出刺激后的最大效應(Emax)。待刺激停止后肌條恢復平衡以后，再分別依次向浴槽內(nèi)加入其選擇性的LPA1和LPA3受體的拮抗劑Ki16425(10-5mol/L)。在大約20分鐘以后再分別行EFS，并進行加藥前后EFS刺激對人LES出現(xiàn)反應的對比。用肌條的收縮或舒張百分比的均數(shù)±標準誤（(x)±SE）來表示EFS刺激誘發(fā)的肌條的反應。
　　結果:

26、r>　　1 EFS能夠誘導人的食管下括約肌中的鉤狀纖維發(fā)生頻率依賴性的舒張反應，其最大的舒張時的電刺激頻率為64Hz，當每一次舒張反應結束以后，其肌條出現(xiàn)反跳性收縮，也是呈頻率的依賴模式。EFS誘導鉤狀纖維的最大舒張百分比是17.8±0.7％。其套索纖維對EFS的反應表現(xiàn)呈頻率依賴性的收縮反應，其最大的收縮時的電刺激頻率為128Hz。EFS誘導套索纖維的最大收縮百分比是17.0±0.8％。
　　2選擇性的LPA1和LPA3受體拮抗

27、劑Ki16425在EFS引起的人食管下括約肌中的鉤狀和套索纖維頻率依賴性舒張或收縮反應中的作用:選擇性LPA1和LPA3受體拮抗劑Ki16425（10-5mol/L）對電場刺激誘發(fā)的人食管下括約肌中的鉤狀纖維頻率依賴性舒張反應沒有影響，對比其用藥前后其舒張的效應沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。選擇性LPA1和LPA3受體拮抗劑Ki16425(10-5mol/L)對電場刺激誘發(fā)的人食管下括約肌中的套索纖維頻率依賴性收縮反應沒有影響，對比其

28、用藥前后收縮的效應沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結論:
　　1電場刺激能夠誘導人食管下括約肌中的鉤狀纖維發(fā)生頻率依賴性的舒張反應。其最大舒張時的電刺激頻率為64Hz。電場刺激能夠誘導人食管下括約肌中的套索纖維發(fā)生頻率依賴性收縮反應，其最大收縮時的電刺激頻率為128Hz。
　　2應用選擇性LPA1和LPA3受體拮抗劑Ki16425以后，對比其用藥前后EFS所誘發(fā)人LES中的鉤狀纖維發(fā)生頻率依賴性的舒張反應，其用藥