成年小鼠心臟干細胞的分離、培養(yǎng)及其離子通道特性.pdf

1、長期以來人們認(rèn)為成年哺乳動物心臟處于后有絲分裂期，即心臟是終末分化器官，不具備自我更新的能力。心臟內(nèi)有絲分裂的發(fā)現(xiàn)，使人們認(rèn)識到心臟內(nèi)有可能存在著干細胞。新近的一些實驗結(jié)果證實了心臟干細胞的存在，這些發(fā)現(xiàn)立即受到生物醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注。 現(xiàn)在已經(jīng)從成年人和其他哺乳動物心臟中分離得到了心臟干細胞。通過細胞移植或是原位激活，心臟干細胞都有能力再生肌細胞，并能改善心臟功能。然而各家報道的心臟干細胞分離培養(yǎng)的方法不盡相同。關(guān)于心臟干細胞在

2、分化前的離子通道特性至今未見報道。本實驗致力于建立一種有效的、重復(fù)性好的成年小鼠心臟干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定方法，并在此基礎(chǔ)上研究心臟干細胞在分化前存在的離子通道的類型及其特性。 第一部分、成年小鼠心臟干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。 成年小鼠心臟干細胞的分離采用Langendorff法灌流小鼠心臟，用膠原酶酶解法制備單個心肌細胞，差速離心法將較大的細胞（如心室肌細胞）和較小的細胞分離開。取用較小細胞，用c-kit抗體孵育后，

3、然后用免疫磁珠分離法分離心臟干細胞。結(jié)果顯示，分離出的細胞數(shù)約104個，細胞形態(tài)為圓形，鏡下觀察較亮，每個細胞上帶有一個或者多個磁珠，細胞直徑較小，約在4～10μm之間。 成年小鼠心臟干細胞的培養(yǎng)分離的細胞先在有血清培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)48小時以除去貼壁雜細胞，然后將懸浮細胞轉(zhuǎn)移到另一新培養(yǎng)皿中，在改良神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基條件下繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)兩天后，有少量細胞開始貼壁，培養(yǎng)五天后，較多細胞開始貼壁生長，七到十天后，形成小克隆

4、，并可持續(xù)生長。 成年小鼠心臟干細胞的鑒定新鮮分離的原代細胞和傳代培養(yǎng)后的細胞采用免疫熒光法鑒定其表型，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察熒光。結(jié)果顯示，原代細胞和傳代細胞表面都帶有綠色熒光，證明其表型為c-kit，心臟干細胞傳代培養(yǎng)后其表型沒有發(fā)生變化。此結(jié)果說明，傳代后細胞保持了干細胞特性，沒有發(fā)生分化。 第二部分、成年小鼠心臟干細胞離子通道特性。 培養(yǎng)的小鼠CSCs 在貼壁生長形成較大克隆之后，用0.25％胰蛋白

5、酶消化，當(dāng)大部分細胞回縮變圓之后，用血清終止消化。細胞一部分用于傳代，一部分保存用于膜片鉗實驗。應(yīng)用全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗模式下記錄離子通道電流。 結(jié)果顯示，未分化的成年小鼠心臟干細胞上存在離子電流。我們記錄到兩種類型的電流，一種為外向電流，激活速度較慢，另一種為內(nèi)向電流。大部分的心臟干細胞上所記錄到的電流為外向電流，激活速度緩慢，呈電壓依賴性，具有非失活特性。此外向電流對TEA敏感，能被TEA可逆性的抑制，該電流為延遲