小檗堿抗心肌肥厚細(xì)胞模型的作用及機(jī)制研究.pdf

1、心肌肥厚是心肌工作超負(fù)荷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，以心肌細(xì)胞蛋白合成增加與細(xì)胞體積增大為主要特征。心肌肥厚本身是一種代償性反應(yīng)，也是啟動(dòng)心功能衰竭的一個(gè)病理過程，并已成為引起心血管疾病發(fā)病率和死亡率顯著升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，探明心肌肥厚發(fā)生機(jī)制，尋求防治心肌肥厚藥物，是心血管領(lǐng)域研究的重要課題。 小檗堿(berberine)是存在于黃連、黃柏等植物中的一種主要生物堿。本課題組已經(jīng)對(duì)小檗堿抗心肌肥厚作用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研

2、究表明，小檗堿具有改善多種心肌肥厚模型動(dòng)物形態(tài)學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)和神經(jīng)體液系統(tǒng)異常改變的藥理作用。 本課題建立在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型，從形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等方面觀察小檗堿對(duì)肥厚刺激因子誘導(dǎo)的心肌肥厚細(xì)胞模型的影響，初步得到以下結(jié)果與結(jié)論： 1.乳鼠心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定 1．1心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 目的：培養(yǎng)符合實(shí)驗(yàn)要求的

3、心肌細(xì)胞。方法：采用酶消化法將心肌組織消化為單細(xì)胞懸液，差速貼壁法分離心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，吸取未貼壁細(xì)胞，加入Brd-U抑制非心肌細(xì)胞生長(zhǎng)，得到純化的心肌細(xì)胞；并進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)及形態(tài)學(xué)和免疫化學(xué)鑒定。結(jié)論：心肌細(xì)胞活性和純度符合實(shí)驗(yàn)要求。 1．2心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 目的：培養(yǎng)符合實(shí)驗(yàn)要求的心肌成纖維細(xì)胞。方法：采用酶消化法將心肌組織消化為單細(xì)胞懸液，差速貼壁法分離心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，棄去未貼壁細(xì)胞，

4、貼壁細(xì)胞即心肌成纖維細(xì)胞；并進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)、形態(tài)學(xué)和免疫化學(xué)鑒定及繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)論：心肌成纖維細(xì)胞活性和純度符合實(shí)驗(yàn)要求。 2.小檗堿對(duì)正常心肌細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞的影響 2.1小檗堿對(duì)正常心肌細(xì)胞的影響 目的：觀察小檗堿對(duì)正常心肌細(xì)胞的影響。方法：分別采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性、圖像分析軟件測(cè)定細(xì)胞面積和考馬斯亮蘭法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白含量，觀察小檗堿1.25、5、10、20μg/ml對(duì)正常心肌細(xì)胞作用48小時(shí)

5、的影響。結(jié)論：小檗堿1.25～10μg/ml是作用于心肌細(xì)胞的安全濃度范圍。 2.2小檗堿對(duì)正常心肌成纖維細(xì)胞的影響 目的：觀察小檗堿對(duì)正常心肌成纖維細(xì)胞的影響。方法：分別采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性、圖像分析軟件測(cè)定細(xì)胞面積和考馬斯亮蘭法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白含量，觀察小檗堿1.25、5、10、20μg/ml對(duì)正常心肌成纖維細(xì)胞作用48小時(shí)的影響。結(jié)論：小檗堿1.25～10μg/ml是作用于心肌成纖維細(xì)胞的安全濃度范圍。

6、3.小檗堿對(duì)心肌細(xì)胞肥厚模型的影響 3.1小檗堿對(duì)異丙腎上腺素致心肌細(xì)胞肥厚模型的影響 目的：觀察小檗堿對(duì)異丙腎上腺素致心肌細(xì)胞肥厚模型的影響。方法：采用10<'-6>mol/L異丙腎上腺素建立心肌細(xì)胞肥厚模型，造模與給藥同時(shí)進(jìn)行，分別觀察小檗堿1.25、2.5、5、10μg/ml，美托洛爾10<'-5>mol/L，卡托普利10<'-5>mol/L，氯沙坦10<'-5>mol/L，對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚模型細(xì)胞

7、活性、細(xì)胞面積和蛋白含量的影響。結(jié)論；小檗堿可抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚模型細(xì)胞面積和蛋白含量的增加。 3.2小檗堿對(duì)血管緊張素Ⅱ致心肌細(xì)胞肥厚模型的影響 目的：觀察小檗堿對(duì)血管緊張素Ⅱ致心肌細(xì)胞肥厚模型的影響。方法：采用10<'-6>mol/L，血管緊張素Ⅱ建立心肌細(xì)胞肥厚模型，造模與給藥同時(shí)進(jìn)行，分別觀察小檗堿1.25、2.5、5、10μg/ml，氯沙坦10<'-5>mol/L，卡托普利10<'-5>mol/

8、L，美托洛爾10<'-5>mol/L對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚模型細(xì)胞活性、細(xì)胞面積和蛋白含量的影響。結(jié)論：小檗堿可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚模型細(xì)胞面積和蛋白含量的增加。 4.小檗堿對(duì)心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型的影響 4.1小檗堿對(duì)異丙腎上腺素致心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型的影響 目的：觀察小檗堿對(duì)異丙腎上腺素致心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型的影響。方法：采用10<'-5>mol/L異丙腎上腺素建立心肌成纖維細(xì)胞肥

9、厚模型，造模與給藥同時(shí)進(jìn)行，分別觀察小檗堿1.25、2.5、5、10μg/ml，美托洛爾10<'-5>mol/L，卡托普利10<'-5>mol/L，氯沙坦10<'-5>mol/L對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型細(xì)胞活性、面積、蛋白和膠原蛋白含量的影響。結(jié)論：小檗堿可抑制異丙腎上腺素所致心肌成纖維細(xì)胞增生和膠原蛋白含量增加，從而抑制心肌纖維化，改善心室重構(gòu)。 4.2小檗堿對(duì)血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型的影響

10、 目的：觀察小檗堿對(duì)血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型的影響。方法：采用10<'-6>mol/L血管緊張素Ⅱ建立心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型，造模與給藥同時(shí)進(jìn)行，分別觀察小檗堿1.25、2.5、5、10μg/ml，氯沙坦10<'-5>mol/L，卡托普利10<'-5>mol/L，美托洛爾10<'-5>mol/L對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型細(xì)胞活性、面積、蛋白和膠原蛋白含量的影響。結(jié)論：小檗堿可抑制血管緊張素Ⅱ所致心肌成纖維細(xì)

11、胞增生和膠原蛋白含量增加，從而抑制心肌間質(zhì)纖維化，改善心室重構(gòu)。 5.小檗堿對(duì)血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞分泌肥厚促進(jìn)/抑制因子的影響 5.1小檗堿對(duì)血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞分泌NO和NOS活性的影響 目的：觀察小檗堿對(duì)血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞分泌NO含量和NOS活性的影響。方法：建立血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型，加藥48小時(shí)后分別觀察下列指標(biāo)：采用硝酸還原法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量、化學(xué)比色法測(cè)

12、定總NOS和iNOS的活性。結(jié)論：小檗堿抗心肌纖維化作用可能與提高NO-NOS系統(tǒng)活性有關(guān)。 5.2小檗堿對(duì)血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞分泌TGF-β<,1>的影響 目的：觀察小檗堿對(duì)血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞分泌TGF-β<,1>含量的影響。方法：建立血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型，加藥48小時(shí)后采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β<,1>含量。結(jié)論：小檗堿抑制心肌間質(zhì)膠原增生、心肌纖維化可能與抑制心肌成

13、纖維細(xì)胞分泌TGF-β<,1>有關(guān)，但其具體機(jī)制仍需深入研究。 6.小檗堿對(duì)血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型細(xì)胞胞漿p38<'MAPK>表達(dá)的影響 目的：觀察小檗堿對(duì)血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型細(xì)胞胞漿p38<'MAPK>表達(dá)的影響。方法：建立血管緊張素Ⅱ致心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型，加藥48小時(shí)后采用免疫細(xì)胞化學(xué)法分別觀察小檗堿2.5、10μg/ml，氯沙坦10<'-5>5mol/L對(duì)心肌成纖維細(xì)胞胞漿p38<

14、'MAPK>表達(dá)的影響。結(jié)論：小檗堿抗心肌肥厚作用可能與激活p38MAPKs通路有關(guān)，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。 綜上所述，小檗堿在1.25～10μg/ml濃度范圍內(nèi)對(duì)正常心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞活性、面積和蛋白含量無(wú)明顯影響。小檗堿可抑制異丙腎上腺素和血管緊張素Ⅱ所致心肌細(xì)胞肥厚模型細(xì)胞面積和蛋白含量的增加，對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響；可抑制異丙腎上腺素和血管緊張素Ⅱ所致心肌成纖維細(xì)胞肥厚模型細(xì)胞增殖、面積、蛋白和膠原蛋白含量的增加。小檗