小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的構(gòu)建.pdf

1、目前的研究認(rèn)為動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)生、發(fā)展到轉(zhuǎn)歸是一種慢性炎癥反應(yīng)的病理過程，有大量的免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與其中。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells,DCs）作為目前已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell,APC），也是唯一能在體內(nèi)直接激活初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化，刺激初始T淋巴細(xì)胞增殖、介導(dǎo)免疫耐受等方面發(fā)揮著重要作用。然

2、而DCs在體內(nèi)的數(shù)量較少，僅占外周單核細(xì)胞的1％左右，如此稀少的數(shù)量給其免疫功能的研究帶來了不小的困難。因此，能夠在體外準(zhǔn)確、高效的培養(yǎng)出DCs并對其鑒定，為其后續(xù)再AS小鼠模型上進(jìn)行免疫功能實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1.通過提取小鼠骨髓細(xì)胞，采用rmGM-CSF、rmIL-4等細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)，建立一種在體外環(huán)境下培養(yǎng)DCs的體系，為課題后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)。
　　2.對體外環(huán)境下培養(yǎng)出來的DCs從形態(tài)學(xué)、表面

3、分子的表達(dá)情況及對同種異基因T細(xì)胞的刺激增殖能力三個方面進(jìn)行鑒定。
　　方法：
　　1.小鼠骨髓源性DCs的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)
　　頸椎脫臼法將雄性C57BL/6小鼠處死，在無菌條件下取出小鼠雙側(cè)股骨、脛骨，用1ml注射器抽取RPMI1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液經(jīng)400目濾網(wǎng)過濾，去除組織碎片。加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，用RPMI1640全培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5x105/ml，加入細(xì)胞

4、因子，分裝于培養(yǎng)瓶，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后收集懸浮細(xì)胞，離心去除上清液，補(bǔ)充培養(yǎng)液及細(xì)胞因子，以后隔日半量換液，第5天將收集的懸浮細(xì)胞分成兩組，一組在培養(yǎng)液中加入LPS（1μg/ml）刺激成熟，培養(yǎng)至第7天收集懸浮細(xì)胞，另一組不做LPS刺激處理，培養(yǎng)至第7天收集懸浮細(xì)胞。
　　2.小鼠骨髓源性DCs的鑒定
　　2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　倒置顯微鏡下動態(tài)觀察DCs的生長與形態(tài)的變化并攝影記錄

5、r>　　2.2流式檢測DCs表面分子
　　分別收集兩組細(xì)胞離心后去上清，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照流式抗體說明書進(jìn)行抗體標(biāo)記及同型對照標(biāo)記，4℃避光孵育30min，離心洗滌，流式檢測兩組細(xì)胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)情況
　　2.3MTT法檢測同種異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）
　　頸椎脫臼法處死BALB/c小鼠，無菌條件下取出其脾臟，剪碎研磨，得到細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分離液分離出單核細(xì)胞，尼龍毛柱法獲得同種異體

6、T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整密度為2x106/ml。取上述方法獲得的imDCs和mDCs，分別按照DC:T細(xì)胞比例為1:5、1:10、1:20、1:40的反應(yīng)比鋪于96孔板中，在37℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)72h，共培養(yǎng)結(jié)束前4h，在每孔中加入20μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔吸取培養(yǎng)液后加入150μl的DMSO，室溫震蕩，酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度（A）值，檢測波長為570nm。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　倒

7、置顯微鏡下可見培養(yǎng)48h后，部分細(xì)胞開始出現(xiàn)半懸浮狀態(tài)，并形成細(xì)胞集落，少量細(xì)胞表面出現(xiàn)毛刺狀突起。培養(yǎng)的第5天鏡下觀察可見大量細(xì)胞集落，細(xì)胞集落表面可見大量長短不一的突起，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，呈懸浮狀態(tài)。加入LPS刺激48h后，可見大量毛刺狀突起的DCs從集落釋放出來，呈游離狀態(tài)，而未加LPS刺激的DCs仍呈集落聚集生長。
　　2.流式檢測DCs表面分子
　　細(xì)胞培養(yǎng)第7天分別收集兩組細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)分析其表面分子的表達(dá)情

8、況。結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞均高表達(dá)CD11c分子，純度>90%。未加 LPS刺激組的DCs低表達(dá)CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子，細(xì)胞表現(xiàn)為未成熟狀態(tài)，而在LPS刺激組這些表面分子則呈現(xiàn)出明顯的高表達(dá)，細(xì)胞表現(xiàn)為成熟狀態(tài)。
　　3.MTT法檢測同種異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)
　　單因素析因方差分析結(jié)果顯示兩組DCs刺激T細(xì)胞增殖的能力隨著DCs所占比例的增大而增強(qiáng)，在相同比例條件下，imDCs刺激 T細(xì)胞增殖的能力顯著低于mDCs