P-gp在卵巢癌細胞對紫杉醇耐藥中的作用及耐藥逆轉的研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性健康?；熓锹殉舶┬g后的重要輔助治療手段, 紫杉醇在卵巢癌化療中占有重要地位。但卵巢癌在經過數(shù)個療程化療后,腫瘤細胞往往會出現(xiàn)獲得性耐藥,致使后續(xù)化療失敗。因此,如何克服卵巢癌化療的多藥耐藥(multidrug resistance ,MDR)成為近年來腫瘤臨床研究的熱點。 紫杉醇耐藥的機制很多，涉及P-糖蛋白(P-glyco-protein, P-gp)表達的升高，微管β亞基的

2、改變，微管α亞基的改變，凋亡途徑改變等。P-gp 是多藥耐藥基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)編碼的一種跨膜轉運蛋白，具有ATP 酶活性，能將化療藥物從細胞內泵出，降低細胞內的有效藥物濃度而致多藥耐藥。而P-gp 又由蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)磷酸化而具有活性。因此，我們培養(yǎng)了對紫杉醇耐藥的卵巢癌細胞A2780/Taxol，研究其P-gp 及PKC 的表達，觀察使用PK

3、C 抑制劑和激動劑后P-gp 表達量及功能的變化，同時應用RNAi 技術沉默P-gp 的表達并觀察沉默后的耐藥細胞內藥物蓄積的濃度，為逆轉耐藥提供依據(jù)。 目的： 1.培養(yǎng)對紫杉醇耐藥的卵巢癌細胞A2780/Taxol，研究其表面P-gp 及PKC-α的表達； 2.觀察使用PCK 抑制劑SP 和激動劑PMA 后A2780/Taxol 細胞表面P-gp表達量及功能的變化； 3.應用RNAi 沉默A2780/T

4、axol 細胞MDR1基因，下調其表面P-gp 的表達并觀察沉默后的耐藥細胞內藥物蓄積的濃度，明確沉默MDR1 基因后表達后能否逆轉耐藥。 方法： 1.免疫細胞化學及免疫熒光雙標檢測PKC-α與P-gp 在耐藥細胞A2780/Taxol 及其親本細胞中的表達； 2.Westernblot 檢測并半定量分析PKC 激動劑PMA 和抑制劑SP 作用后P-gp 在兩種細胞上的表達水平； 3.以R123 作為熒光

5、探針,采用流式細胞儀檢測PMA 及SP 對細胞內藥物濃度的影響； 4.構建RNAi MDR1真核表達載體，經脂質體轉染至A2780/Taxol 細胞，Westernblot 檢測P-gp 沉默效果，MTT 法繪制生長曲線，并按方法3 檢測細胞內藥物蓄積濃度。 結果： 1.免疫細胞化學結果表明在A2780/Taxol 中，P-gp 與PKC 表達均呈陽性，而在親本細胞中，P-gp 不表達，PKC 呈陽性表達。免疫熒

6、光雙標結果顯示在A2780/Taxol 中PKC-α與P-gp 有共表達。 2.SP 及PMA 作用后，A2780/Taxol 細胞中P-gp 的表達量無明顯差別。 3.PMA 作用后A2780/Taxol 細胞內R123 的平均熒光強度減低,SP 作用后,A2780/Taxol 細胞內R123 的平均熒光強度明顯增加。敏感細胞A2780 則無此現(xiàn)象。 4.成功構建RNAi MDR1 真核表達載體，轉染至A278

7、0/Taxol 細胞，G418篩選，成功獲得陽性克隆株。5.MTT 結果提示轉染后的各組細胞生長曲線無明顯差別。Westerblot 結果顯示A2780/Taxol 細胞MDR1 基因被特異沉默了，但是針對不同部位序列的shRNA 真核表達載體抑制效率不同，R123 外排實驗結果顯示轉染后的A2780/Taxol/ pWH1- MDR12 細胞內藥物蓄積濃度明顯大于A2780/Taxol細胞。 結論： 1.卵巢癌細胞A2

8、780 對紫杉醇耐藥性產生與P-gp 過表達有關； 2.PKC 活性的改變并不能改變A2780/Taxol 細胞P-gp 的表達量，但是可以通過使P-gp 磷酸化增強或減弱來增高或降低其跨膜轉運功能； 3.RNAi 技術特異性沉默A2780/Taxol 細胞MDR1 的表達后，細胞內藥物蓄積濃度明顯增高。 4.采用PKC 抑制劑抑制A2780/Taxol 細胞P-gp 的功能或利用RNAi 技術降低其表面P-gp