海帶低分子量巖藻聚糖硫酸酯的制備及其抗血栓活性研究.pdf

1、我國每年心血管疾病死亡者占因病死亡總?cè)藬?shù)的40.7％。其比例遠高于人類大敵癌癥,居各類死因之首,而血栓形成為其主要因素。因此,開發(fā)天然、高效、毒副作用小的抗血栓藥物成為當今醫(yī)藥領(lǐng)域研究的重點。
　　 巖藻聚糖硫酸酯是是褐藻中特有的一種含有硫酸酯的水溶性雜聚糖,化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)隨海藻的種類、生長季節(jié)和提取方法的不同而不同。目前對羊棲菜、泡葉藻、昆布等制備的巖藻聚糖硫酸酯的研究較多,但關(guān)于海帶中巖藻聚糖硫酸酯的研究大多為大分子的雜多糖

2、,結(jié)構(gòu)不清楚,無法解釋作用機理,所以有必要對我國海域內(nèi)生長的海帶中的巖藻聚糖硫酸酯進行結(jié)構(gòu)的深入分析,并聯(lián)系其抗血栓活性,進行構(gòu)效關(guān)系的研究,本文主要從以下兩個方面進行研究:
　　 一、以我國黃海海域生長的海帶提取的巖藻聚糖硫酸酯粗糖為原料,用Q-Sepharose FF陰離子交換分離純化得到中分子量巖藻聚糖硫酸酯,自由基氧化降解法得到低分子量的巖藻聚糖硫酸酯,在不同分子量巖藻聚糖硫酸酯的制備和化學(xué)分析過程中,我們對不同制備條件

3、下所得產(chǎn)物的得率、分子量分布、硫酸根含量、中性糖組成及官能團進行了分析,對測定硫酸根的傳統(tǒng)氯化鋇-明膠法進行了改進并將改進后的方法與離子色譜法進行對比,得出一種適合在海帶巖藻聚糖硫酸酯中測定硫酸根含量的最佳方法。具體結(jié)果如下:
　　 1)通過Q-Sepharos FF陰離子交換制備得到中分子量巖藻聚糖硫酸酯的重均分子量和數(shù)均分子量為F1:28000和19000,F2:35000和28000。硫酸根含量為9.52％和19.87％.

4、硫酸根連接在糖的C2或C3位處于平伏鍵位置。F2硫酸根含量最高,主要含有巖藻糖和半乳糖。
　　 2)自由基降解海帶巖藻聚糖硫酸酯粗糖時,9％H2O2和4.5％H2O2氧化降解所得的低分子量巖藻聚糖硫酸酯在300-2500Da內(nèi)的組分無顯著差別,分子量為1.5kDa,組分集中。4.5％H2O2氧化降解粗糖所得的低分子量巖藻聚糖硫酸酯在6000-10000Da之間的組分分布集中,重均和數(shù)均分子量分別為7900和7600。2500-6

5、000Da之間的組分得率最高,大于30％,重均和數(shù)均分子量分別為3500和2800,分子量分布比6000-10000Da組分寬。9％H2O2氧化降解粗糖得到的低分子量糖的硫酸根含量明顯低于4.5％的H2O2。在6000-10000Da之間的降解產(chǎn)物得率很少,小于1％。產(chǎn)物主要集中在2500-6000Da。4.5％H2O2氧化降解4.5g粗糖所得的低分子量巖藻聚糖硫酸酯在2500-10000Da內(nèi)的組分LMWF4硫酸根含量最高,為30.2

6、8％。將其用6KDa的超濾膜分離后得到3.31KDa的LMWF4a和7.74KDa的LMWF4b,硫酸根含量分別為32.48％和30.32％。LMWF4b主要含有巖藻糖和半乳糖,比例是2:1。LMWF4a的巖藻糖低于LMWF4b,半乳糖、葡萄糖和甘露糖含量升高。降解后的低分子量巖藻聚糖硫酸酯在820cm-1處有的吸收峰,有可能在C2和C4之間形成雙硫取代。說明自由基氧化降解巖藻聚糖硫酸酯,過氧化氫濃度越高,產(chǎn)物的分子量越低,產(chǎn)物的硫酸根

7、和巖藻糖的含量也會下降。
　　 3)實驗中發(fā)現(xiàn)氯化鋇-明膠溶液不穩(wěn)定和溶液中存在的大量氣泡是造成傳統(tǒng)氯化鋇-明膠法測定硫酸根含量穩(wěn)定性差、精密度低的兩個重要原因,因此采用加熱溶劑和脫氣法對傳統(tǒng)氯化鋇-明膠法進行改進。改進后的氯化鋇-明膠法相關(guān)系數(shù)為0.9991,比傳統(tǒng)氯化鋇一明膠法的相關(guān)系數(shù)明顯提高,說明改進后的氯化鋇-明膠法精密度高,穩(wěn)定可靠,并且實驗試劑和儀器成本低,適合普通實驗室和化驗室測定海帶巖藻聚糖硫酸酯中硫酸根含量的

8、使用;而離子色譜法在測定海帶巖藻聚糖硫酸酯中硫酸根的含量時比氯化鋇-明膠法所需樣品少,不受其他離子及雜質(zhì)的干擾。利用F檢驗,發(fā)現(xiàn)離子色譜法在測定海帶巖藻聚糖硫酸酯硫酸根時的精密度比改進后的氯化鋇-明膠法更高,操作簡便、快捷,適合在海帶巖藻聚糖硫酸酯的硫酸根含量的檢測中推廣。
　　 二、利用制備出的中分子量巖藻聚糖硫酸酯和高硫高巖藻糖的低分子量巖藻聚糖硫酸酯,選用直流電刺激誘導(dǎo)大鼠頸動脈形成血栓模型,進行抗血栓活性的研究,并用有效

9、抑制血栓效果劑量的巖藻聚糖硫酸酯對正常實驗動物的凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)和血小板系統(tǒng)進行分析,結(jié)合血小板的人體外實驗,探討中分子量巖藻聚糖硫酸酯和低分子量巖藻聚糖硫酸酯的作用機理,具體結(jié)果如下:
　　 1)巖藻聚糖硫酸酯具有很好的抑制動脈血栓生成的活性,比較血管全阻塞時間發(fā)現(xiàn),巖藻聚糖硫酸酯的分子量越大,抗血栓能力越強。0.1-0.25mg/kg的中分子量組分F1和F2能夠顯著地抑制血栓的生成,抑制血栓生成所需要的濃度顯著低于肝素和低

10、分子量巖藻聚糖。而2.5-10mg/kg低分子巖藻聚糖可以顯著抑制抗血栓的生成,并且抗栓活性隨著濃度的升高而升高。對血栓模型大鼠血漿中TXB2和6-keto-PGF1α的研究發(fā)現(xiàn),中分子量巖藻聚糖硫酸酯F1和F2可以顯著降低TXB2的含量,抑制血小板激活,但對內(nèi)皮細胞分泌6-keto-PGF1α的影響不大。低分子量巖藻聚糖硫酸酯可以顯著降低TXB2的含量,升高6-keto-PGF1α的含量,提高TXB2/6-keto-PGF1α的比值,

11、二者共同作用抑制血小板激活,進而抑制血栓形成。中分子量巖藻聚糖硫酸酯和低分子量巖藻聚糖硫酸酯均可以提高血清中TFPI的含量,說明能夠延長外源性凝血途徑中的組織因子途徑,從而抑制血栓的形成。
　　 2)對正常大鼠注射具有抗栓效果的巖藻聚糖硫酸酯后,對血漿中APTT值、PT值、TT值、ATIII含量和FIB含量的比較發(fā)現(xiàn),巖藻聚糖硫酸酯對APTT、TT有顯著延長,而對PT和FIB含量沒有影響,說明巖藻聚糖硫酸酯可以作用于內(nèi)源凝血系統(tǒng)

12、,而對外源凝血途徑?jīng)]有影響。低分子巖藻聚糖硫酸酯抗栓活性需要的濃度高于中分子量組分,其抗凝血活性也高于中分子量組分,尤其是LMWF4b延長APTT的作用極顯著高于中分子量組分和低分子量的LMWF4a,活性隨著濃度的增大而升高。巖藻聚糖硫酸酯對TT的延長效果低于肝素,而且無劑量關(guān)系。
　　 3)對正常新西蘭白兔注射具有抗栓效果的巖藻聚糖硫酸酯后發(fā)現(xiàn),中分子量巖藻聚糖硫酸酯對t-PA、PAI均無顯著影響,但是可以顯著提高t-PA/P

13、AI的百分比,對纖溶系統(tǒng)的激活作用尚待繼續(xù)研究。低分子量巖藻聚糖硫酸酯體內(nèi)可顯著夠縮短全血漿凝塊溶解時間,LMWF4b可以降低優(yōu)球蛋白溶解時間,并能夠顯著升高兔子血清中t-PA活性,提高t-PA/PAI的百分比,表明低分子量巖藻聚糖硫酸酯對纖溶途徑還有激活作用。但所有巖藻聚糖硫酸酯對尿激酶型纖溶酶原激活物沒有顯著作用。
　　 4)對人血小板的體外實驗發(fā)現(xiàn),巖藻聚糖硫酸酯對不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集的作用不同。中分子量巖藻聚糖硫酸

14、酯F1和F2對ADP、從、凝血酶誘導(dǎo)的人血小板聚集無抑制作用,相反有促進血小板聚集的作用。低分子量巖藻聚糖硫酸酯都具有促進從的誘導(dǎo)的血小板的聚集作用,LMWF4a對ADP誘導(dǎo)血小板聚集的抑制活性顯著大于LMWF4b,LMWF4b對凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集能力大于LMWF4a。
　　 5)巖藻聚糖硫酸酯采用靜脈注射給予正常大鼠后,大鼠血漿中血小板聚集的實驗發(fā)現(xiàn),中分子量巖藻聚糖硫酸酯F1和F2對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集無影響,對從和凝