核酸基礎(chǔ)序列擴(kuò)增即刻早期核糖核酸在腎移植術(shù)后巨細(xì)胞病毒感染中的應(yīng)用研究.pdf

1、自從1954年首次成功在孿生子問進(jìn)行腎移植以來，經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的不懈努力，腎移植技術(shù)已從探索走向成熟。近年來，由于技術(shù)的改進(jìn)，對免疫學(xué)認(rèn)識的深入以及強(qiáng)有力免疫抑制劑的問世，患者的近中期生存率及生活質(zhì)量已有極大的改善，1年尸腎存活率已達(dá)96％，5年腎存活率達(dá)80％。但是器官移植后受者的人類巨細(xì)胞病毒(Humancytomegalovirus,HCMV)感染仍然是導(dǎo)致移植后患者死亡的主要原因之一。移植術(shù)后CMV肺部感染發(fā)生率為20％～70％，

2、且15％～35％為有癥狀的CMV病，典型的CMV肺部感染多發(fā)生于移植術(shù)后1～6個(gè)月內(nèi)。CMV在全世界成人中感染率為60％～100％，多為潛伏性感染，機(jī)體表現(xiàn)為持續(xù)血清學(xué)陽性(即抗CMV抗體IgG陽性)。當(dāng)免疫功能下降、特別是細(xì)胞免疫力低下時(shí)，機(jī)體又可新感染CMV，或潛伏的病毒再次激活、復(fù)制，形成活動性CMV感染，重者則發(fā)生明顯的“CMV病”，在這種情況下，CMV常與其他病原體使免疫功能低下者發(fā)生二重或多重感染，病情兇險(xiǎn)，死亡率高。CMV

3、肺部感染被認(rèn)為不僅是器官移植術(shù)后近期死亡的重要原因，而且還可能與急性排斥反應(yīng)和慢性移植物失功有關(guān)。如能早期診斷活動性CMV感染，并及時(shí)給予抗病毒治療可有效改善免疫受抑制和免疫缺陷病人活動性HCMV感染的癥狀，降低其疾病的嚴(yán)重性和死亡率。因此，在監(jiān)測CMV易感病人時(shí)，應(yīng)及早而準(zhǔn)確地把握病人是否發(fā)生活動性HCMV感染，這樣才能及時(shí)治療活動性感染的病人，又使未發(fā)生活動性感染的病人免受抗病毒藥的毒性損害。 第一部分建立NASBBA法檢測

4、即刻早期核糖核酸的實(shí)驗(yàn)條件及在器官移植后巨細(xì)胞病毒感染診斷中的初步實(shí)驗(yàn)研究 目的：器官移植術(shù)后CMV感染是導(dǎo)致移植后患者死亡的主要原因之一，因而早期、快速而準(zhǔn)確地診斷CMV活動性感染已成為監(jiān)測CMV感染狀況、及時(shí)給予抗病毒治療以及判斷預(yù)后的關(guān)鍵。關(guān)于CMV的診斷方法很多，如病毒包涵體檢查、病毒分離培養(yǎng)、血清抗體檢測及DNA聚合酶反應(yīng)(PCR)、CMV抗原血癥的檢測等，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但是存在一個(gè)共同的不足之處，即無法區(qū)分CM

5、V潛伏性感染和活動性感染。隨著對CMV基因組的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)即刻早期和晚期基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和病毒復(fù)制緊密相連，由此提出檢測病毒mRNA是快速診斷CMV活動性感染的一項(xiàng)黃金指標(biāo)。近年來，應(yīng)用核酸基礎(chǔ)序列擴(kuò)增(Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)技術(shù)檢測病毒RNA得到了快速發(fā)展。NASBA法檢測RNA是一項(xiàng)引物依賴性的核酸技術(shù)，我院自2000年1月始采用該法測定pp67-

6、mRNA用于移植術(shù)后CMV活動性感染的臨床診斷，取得了許多經(jīng)驗(yàn)，pp67-mRNA檢測雖然特異性高，但敏感度低，而且陽性結(jié)果出現(xiàn)時(shí)間較晚等缺點(diǎn)，不能滿足臨床的需要。為了尋求更好的檢測指標(biāo)，于2004年1月，我們建立了應(yīng)用NASBA法檢測即刻早期核糖核酸(Immediate-earlymRNA，IE-mRNA)的實(shí)驗(yàn)條件，結(jié)合臨床實(shí)際，并與pp67和抗原血癥檢測相比較。 方法：病例為我院2004年1月～2004年6月接受器官移植的

7、患者，共42例，腎移植25例，肝移植13例，骨髓移植4例。術(shù)后每周抽抗凝血一次至術(shù)后3個(gè)月。首先建立NASBA法檢測lE-mRNA的實(shí)驗(yàn)條件及相關(guān)試劑的合成。采用NASBA法檢測IE-mRNA、pp67-mRNA，同時(shí)進(jìn)行免疫組化EnvisionTM二步法檢測pp65抗原血癥。所有患者均采用Pred+MMF+CsA\FK506三聯(lián)免疫抑制治療。術(shù)后采用普遍性預(yù)防抗病毒治療方案，給予丙氧鳥苷2.5～5mg·kg-1·d-1，分2次靜脈滴注

8、，共2周。如患者發(fā)生CMV病則丙氧鳥苷劑量加倍。20例健康成人的血標(biāo)本作為陰性對照。 結(jié)果：42例器官移植術(shù)后患者共收集了134份外周血標(biāo)本，分別進(jìn)行了pp65抗原、pp67-mRNA及IE-mRNA的檢測，有2份標(biāo)本擴(kuò)增野生型mRNA及SC-mRNA失敗，視為無效，有效標(biāo)本數(shù)實(shí)為132份。36份抗原血癥陽性(≥1個(gè)/5萬PMNL)標(biāo)本中有25份IE-mRNA同時(shí)陽性，陽性符合率為69.4％；13份pp67-mRNA陽性標(biāo)本中有

9、11份IE-mRNA陽性，陽性符合率為84.6％。42例移植術(shù)后患者中，檢出pp65抗原陽性(≥1個(gè)/5萬PMNL)25例(陽性檢出率59.5％)，pp67-mRNA陽性11例(陽性檢出率26.2％)，IE-mRNA陽性16例(陽性檢出率38.1％)。發(fā)生有癥狀的活動性CMV感染(CMV病)11例，其中抗原陽性8例，pp67-mRNA陽性6例，IE-mRNA陽性10例。IE-mRNA的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值分別為90.9

10、％、80.6％、62.5％和96.1％。 結(jié)論：(1)NASBA法檢測CMV-mRNA具有便捷、快速、準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)，特異性高，假陽性率低。(2)pp67-mRNA的檢出對疾病診斷具有高的特異性，但敏感度低，不適于作為移植后先發(fā)制人抗病毒治療方案的依據(jù)，可以作為一個(gè)判斷預(yù)后的指標(biāo)。(3)IE-mRNA的檢測具有較理想的敏感性和特異度，IE-mRNA能夠更好的反映CMV活動性感染的狀況，是病毒活動性感染的早期診斷指標(biāo)。 第

11、二部分NASBA法檢測即刻早期核糖核酸在腎移植后巨細(xì)胞病毒感染診斷和指導(dǎo)治療中的意義研究 目的：目前腎移植后抗CMV病的重點(diǎn)是預(yù)防，包括普遍性預(yù)防抗病毒治療和先發(fā)制人(Pre-emptivetherapy)治療。普遍性預(yù)防治療會給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和加重的藥物毒性問題，先發(fā)制人的抗病毒治療方案，可以減少治療的費(fèi)用與藥物毒性而又不會延誤治療，早期檢測到活動性CMV感染是先發(fā)制人方案的先決條件。為了準(zhǔn)確地把握好臨床的用藥時(shí)機(jī)，準(zhǔn)

12、確地開始和終止用藥，減少不必要的經(jīng)濟(jì)損失和藥物毒負(fù)作用等，這就要求實(shí)驗(yàn)室的檢測能夠早期、快速、準(zhǔn)確可靠反映HCMV的活動狀況，同時(shí)能夠動態(tài)地檢測CMV在受者體內(nèi)的活動變化。在此前提下，我們對腎移植術(shù)后55例患者的CMVlE-mRNA、pp67-mRNA、pp65抗原以及血清學(xué)抗體進(jìn)行了動態(tài)檢測，結(jié)合抗病毒治療，尋找一種可用于先發(fā)制人抗病毒治療方案的最佳指標(biāo)。 方法：病例選自我院接受腎移植的患者，共55例，術(shù)前所有供者和受者均采取

13、不抗凝血標(biāo)本，用ELISA檢測CMVIgG和IgM抗體。術(shù)后每周抽EDTA抗凝血一次共3個(gè)月，分別采用NASBA法檢測IE-mRNA、pp67-mRNA和免疫組化EnvisionTM二步法檢測pp65抗原血癥。均采用Pred+MMF+CsA\FK506三聯(lián)免疫抑制治療，發(fā)生急性排斥反應(yīng)者給予MP沖擊治療3～5天，無效者改用ATG或OKT3。初次檢出任何一項(xiàng)陽性結(jié)果時(shí)靜脈給予丙氧鳥苷2.5～5mg·kg-1·d-1，直至轉(zhuǎn)陰后繼續(xù)治療7～

14、14天。發(fā)現(xiàn)CMV病時(shí)丙氧鳥苷劑量加倍，治療無效或出現(xiàn)毒副作用如白細(xì)胞、血小板低下時(shí)改用磷甲酸鈉。 結(jié)果：(1)術(shù)前血清學(xué)狀況及術(shù)后CMV病感染率：術(shù)前供者lgG抗體陽性者15例，接受陽性供體的受者7例為IgG陽性，8例為IgG陰性。接受供者IgG抗體陽性腎臟患者的感染率明顯高于陰性者。(2)CMV抗原指數(shù)檢測結(jié)果：55例患者術(shù)后出現(xiàn)抗原陽性29例(52.7％)，陽性細(xì)胞數(shù)為2.0～60.5/5萬PMNL，平均12.3/5萬PM

15、NL，其中＞10個(gè)/5萬PMNL者17例，＞20個(gè)/5萬PMNL者5例。觀察期內(nèi)(術(shù)后半年內(nèi))發(fā)生有癥狀的活動性CMV感染(CMV病)13例。發(fā)生CMV病者的平均抗原指數(shù)高于非CMV病患者。IE-mRNA陽性患者的平均抗原指數(shù)高于陰性者。(3)IE-mRNA、pp67-mRNA及抗原血癥診斷指標(biāo)比較：55例患者中，pp65抗原血癥陽性29例(52.7％)，pp67-mRNA陽性14例(25.4％)，IE-mRNA陽性20例(36.4％)

16、。發(fā)生有CMV病13例，均接受了更昔洛韋治療，10例治療后檢測結(jié)果陰轉(zhuǎn)，同時(shí)癥狀消失。有2例出現(xiàn)ARDS，其中1例因呼吸衰竭死亡。IE-mRNA的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為92.3％、80.9％、60.0％和97.1％。(4)三項(xiàng)檢測指標(biāo)的動態(tài)變化：lE-mRNA首次檢出平均時(shí)間(31.O±15.4天)，早于pp67-mRNA(43.7±16.3)和pp65抗原血癥(39.6±15.6天)。而pp67-mRNA的平均陰

17、轉(zhuǎn)時(shí)間早于其他兩項(xiàng)。 結(jié)論：(1)腎移植術(shù)前病人的CMV血清學(xué)狀況無論是陽性還是陰性，如果接受CMV陽性供者的腎臟，則術(shù)后感染發(fā)生率明顯高于接受CMV陰性供者腎臟的病人。(2)CMV病患者的平均抗原指數(shù)水平高于非CMV病者，說明抗原指數(shù)與CMV感染的嚴(yán)重程度有一定的關(guān)系。但某些抗原指數(shù)高者可能并無臨床癥狀，而低抗原指數(shù)者也有可能出現(xiàn)明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)。IE-mRNA陽性者的平均抗原指數(shù)高于陰性者。(3)IE-mRNA具有相對合