石斑魚虹彩病毒SGIV胸苷激酶基因克隆、表達(dá)及其分子特征分析.pdf

1、病毒編碼的胸苷激酶(Thymidinekinase，TK)是許多大分子DNA病毒的一種特征基因，包括痘病毒(Poxvirus)和皰疹病毒(Herpesvirus)等。雖然病毒的DNA合成時(shí)通常使用宿主細(xì)胞的胸苷激酶，但有報(bào)道稱病毒的胸苷激酶對(duì)于病毒的復(fù)制和激活有重要作用。石斑魚虹彩病毒(Singaporegrouperiridovirus，SGIV)是大分子DNA病毒，雙鏈環(huán)狀DNA，基因組全長(zhǎng)140,131bp，共有162個(gè)開放閱讀框

2、(Openreadingframe，ORF)，在正反鏈上分別編碼41-1268個(gè)氨基酸。從SGIV克隆得到ORF067全長(zhǎng)cDNA序列，生物學(xué)信息學(xué)分析表明該ORF編碼的是胸苷激酶。SGIVtk基因全長(zhǎng)576bp，編碼191個(gè)氨基酸，分子量為21.6kDa，等電點(diǎn)為6.25。預(yù)測(cè)有五個(gè)功能結(jié)構(gòu)區(qū)，其中在N端的第11-18個(gè)氨基酸“GNIGAGKS”是TK蛋白保守的核苷酸結(jié)合區(qū)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)SGIVTK主要以螺旋為主，包括52.63％的螺

3、旋，9.95％折疊以及37.70％松散結(jié)構(gòu)。 序列相似性分析顯示SGIVTK與已報(bào)道的TK同源性較低，與蛙病毒屬的同源性最高，但也只有48％，這幾種蛙病毒屬代表性病毒包括：Wamena虹彩病毒(Wamenairidovirus，WIV)、流行性造血器官壞死病毒(Epizootichaematopoieticnecrosisvirus，EHNV)、蛙病毒3(Frogvirus3，F(xiàn)V3)、飾紋汀蛙虹彩病毒(Bohleiridovi

4、rus，BIV)和虎蛙病毒(Tigerfrogvirus，TFV)。因而推測(cè)我們所分離克隆的SGIVTK基因是一個(gè)病毒新基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析是基于TK蛋白水平進(jìn)行的，SGIV同臺(tái)灣分離的石斑魚虹彩病毒TGIV(GrouperiridovirusfromTaiwan，TGIV)同源性非常高，相似率達(dá)到99％，二者同蛙病毒屬的病毒較為相近，與利用MCP進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果一致。另外，同其他病毒及細(xì)胞型TK相比較SGIVTK與細(xì)胞型TK2更為

5、相似一些。 將SGIVtk編碼區(qū)克隆到表達(dá)載體pET32a中，在大腸桿菌BL21(DE3)中超量表達(dá)出帶6×His接頭的融合蛋白，大小與預(yù)期分子量一致。將此蛋白免疫BALB/cA小鼠制備了多克隆抗血清。純化融合蛋白，采用放射酶活分析法對(duì)其進(jìn)行活性分析表明，原核重組表達(dá)的融合胸苷激酶具有酶活性，在N端融合部分對(duì)胸苷激酶活性沒有影響。 為了進(jìn)一步研究SGIVtk基因的功能，用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)定量RT-PCR兩種方法研