豬細(xì)小病毒ELISA抗體檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）引起的一種母豬繁殖障礙性疾病。該病引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及延遲發(fā)情等，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。雖然豬細(xì)小病毒疫苗已得到廣泛使用，但豬群中的抗體監(jiān)測(cè)仍十分重要。本研究旨在表達(dá)、純化、篩選診斷抗原，并以此初步建立豬細(xì)小病毒ELISA抗體檢測(cè)方法。
　　具體內(nèi)容如下：
　　1.PPV ELISA抗體檢測(cè)方法包被抗原的篩選
　　為篩選良好的包

2、被抗原，本研究共構(gòu)建了4種豬細(xì)小病毒VP2重組原核表達(dá)質(zhì)粒：VP2-pGEX-KG、VP2-pET-28a-sumo、VP2(469-1316bp)-pGEX-KG、VP2(469-1316bp)-pET-28a-sumo，并分別在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)、純化。通過(guò)SDS-PAGE分析、血凝活性的檢測(cè)及方陣滴定后，選擇了 VP2(469-1316bp)-pET-28a-sumo重組蛋白作為PPV ELISA抗體檢測(cè)方法的包被抗原，并確定其

3、最佳包被量為101.6 ng/孔。
　　2.PPV ELISA抗體檢測(cè)方法的初步建立
　　以 VP2(469-1316bp)-pET-28a-sumo重組蛋白作為包被抗原，進(jìn)行了一系列ELISA條件的摸索，確定了最佳封閉液為0.5％牛血清白蛋白，最佳樣品稀釋液為含0.5%BSA+0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液，酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1:5000，血清、酶標(biāo)二抗、底物的最佳孵育時(shí)間分別為30min、60min及30mi

4、n，判定標(biāo)準(zhǔn)定為樣品S/P≥0.38為陽(yáng)性，S/P<0.38為陰性。
　　3.PPV ELISA抗體檢測(cè)方法的初步評(píng)價(jià)
　　以HI試驗(yàn)檢測(cè)一批臨床血清并確定其血凝抑制效價(jià)，并將該批血清作為標(biāo)準(zhǔn)血清，對(duì)建立的ELISA方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，建立的ELISA方法敏感性良好，批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)為5.32%-14.58%，批間重復(fù)變異系數(shù)為2.89%-11.52%，與HI試驗(yàn)的陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為30%，總符合率為72