水稻維管束發(fā)育相關(guān)基因AVB基因的圖位克隆和功能分析.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是研究植物功能基因的模式作物。水稻的株型研究一直是水稻育種的重點(diǎn)。水稻的地上部位均是由莖端分生組織發(fā)育而來(lái)，在圓頂形SAM的周邊區(qū)域，部分干細(xì)胞分化形成側(cè)生器官原基，由側(cè)生器官原基進(jìn)一步發(fā)育成熟器官的過(guò)程一般可分為細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)兩個(gè)階段，但這兩個(gè)階段并沒(méi)有明顯界限。側(cè)生器官原基的細(xì)胞分裂速度直接決定了最終的細(xì)胞數(shù)目，在決定器官大小方面起著重要作用。在側(cè)生器官原基發(fā)育為成熟器官的過(guò)程中，原形成層細(xì)胞

2、在特定的位置上不斷分化并最終形成維管系統(tǒng)。植物的維管系統(tǒng)連通從根部到地上部分的整個(gè)植物體，長(zhǎng)途運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分并為植物體提供機(jī)械支撐。
　　但由于目前對(duì)調(diào)控側(cè)生器官原基的分化和細(xì)胞分裂速率的分子機(jī)制了解并不深入，需要更多的研究以深化理解。在本研究中，首先我們證明了AVB基因參與維持側(cè)生器官原基正常的細(xì)胞分裂過(guò)程，其次我們證明了AVB基因參與生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的原形成層細(xì)胞的分化過(guò)程，最后我們發(fā)現(xiàn)AVB基因影響原形成層細(xì)胞的細(xì)胞分裂過(guò)程。

3、具體的研究結(jié)果如下：
　　1. avb突變體表型觀察
　　相比于野生型縉恢10號(hào)，avb突變體最明顯的特征是整個(gè)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段葉片變窄，并且隨著生長(zhǎng)的繼續(xù)，葉片變窄的程度逐漸加深。除了葉片變窄外，在成熟期測(cè)量各節(jié)間的直徑發(fā)現(xiàn)相比于野生型，突變體的各節(jié)間直徑也明顯減少了。除了葉片和莖稈變窄，成熟期突變體的穗部也明顯表小了，穗莖軸變窄，一次枝梗和二次枝梗數(shù)目減少。相比于地上部分器官的寬度明顯減小，突變體的葉片長(zhǎng)度及各節(jié)間的長(zhǎng)度并沒(méi)

4、有發(fā)生明顯變化。
　　2. avb突變體組織學(xué)分析
　　為了探明造成 avb突變體地上部分器官變窄的原因，對(duì)野生型和突變體的各個(gè)器官進(jìn)行組織切片，觀察發(fā)現(xiàn)相比于野生型，突變體葉片、葉鞘、莖稈、穗莖軸橫切面上的細(xì)胞總數(shù)顯著減少，且大小維管束的數(shù)目減少，在葉鞘、莖稈和穗莖軸部位還觀察到大小維管束的面積明顯增大，相鄰維管束之間的細(xì)胞數(shù)目增多。同時(shí)發(fā)現(xiàn)相比于野生型，突變體地下根部，一次枝梗和二次枝梗橫切面上細(xì)胞總數(shù)和維管束均無(wú)明顯變

5、化。
　　3. AVB基因遺傳分析和分子定位
　　利用日本晴與avb突變體進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)F1代植株均表現(xiàn)正常，表明突變性狀是受隱性基因控制的；F2代群體出現(xiàn)性狀分離，有正常群體和窄葉群體兩組，正常單株：窄葉單株符合3:1的分離比，表明突變性狀受1對(duì)隱性核基因控制。以日本晴與avb突變體雜交的F2代窄葉單株作為定位群體，利用SSR和InDel標(biāo)記進(jìn)行AVB基因的定位，最終將AVB基因定位在第3染色體長(zhǎng)臂標(biāo)記SF2和SR3之間，

6、物理距離46Kb。
　　4. AVB候選基因克隆和轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證
　　對(duì)定位區(qū)間內(nèi)的8個(gè)注釋基因的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，最終發(fā)現(xiàn)編碼一個(gè)未知功能蛋白的基因Os03g0308200的蛋白編碼區(qū)域發(fā)生了單堿基的改變，由C堿基變?yōu)?T堿基，對(duì)應(yīng)的密碼子由精氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，因此我們初步推測(cè)Os03g0308200基因是AVB基因的候選基因。為了驗(yàn)證候選基因Os03g0308200就是我們要尋找的AVB基因，我們構(gòu)建了包含Os0

7、3g0308200基因全長(zhǎng)序列的互補(bǔ)載體和包含部分cDNA片段的干涉載體，把互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)入avb突變體中發(fā)現(xiàn)突變表型完全恢復(fù)，把干涉載體轉(zhuǎn)入中花11的轉(zhuǎn)基因植株中的Os03g0308200基因表達(dá)量明顯下調(diào)，且葉片明顯變窄且維管束數(shù)目減少，這說(shuō)明Os03g0308200基因就是AVB基因。
　　5. AVB基因的表達(dá)模式分析
　　利用定量PCR分析AVB基因在水稻植株中的表達(dá)情況，使用水稻ACTIN4作為內(nèi)參，以AVB基因在幼

8、穗中的表達(dá)水平作為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)AVB基因在莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)部位表達(dá)水平最高。利用原位雜交觀察 AVB基因在過(guò)莖尖縱切面上的信號(hào)發(fā)現(xiàn)AVB基因信號(hào)主要集中在莖尖部位，說(shuō)明AVB基因的主要表達(dá)位點(diǎn)是莖尖部位。為了進(jìn)一步分析AVB基因在莖尖部位的表達(dá)情況，我們仔細(xì)分析了過(guò)水稻頂端分生組織的橫切和縱切上AVB基因的信號(hào)分布情況，發(fā)現(xiàn)AVB基因的表達(dá)主要集中在頂端分生組織的葉原基啟動(dòng)部位和葉原基，隨著葉原基的分化發(fā)育，AVB基因的表達(dá)集中在原形成層細(xì)胞中

9、。在成熟葉片中，AVB基因的表達(dá)均勻分布在整個(gè)維管束，沒(méi)有韌皮部和木質(zhì)部特異性。
　　6. AVB基因參與生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的原形成層分化過(guò)程
　　考慮到生長(zhǎng)素信號(hào)在原形成層分化中的作用，且在 avb突變體的葉原基發(fā)育過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)原形成層分化數(shù)目減少，我們推測(cè)AVB基因可能與生長(zhǎng)素之間有關(guān)系，為此我們使用活性生長(zhǎng)素IAA和生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑TIBA處理縉恢10號(hào)，發(fā)現(xiàn)在用TIBA處理兩小時(shí)后，莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)部位的AVB基因的表達(dá)量明顯

10、上調(diào)。并且我們?cè)贏VB基因的啟動(dòng)子上發(fā)現(xiàn)了3個(gè)典型的生長(zhǎng)素反應(yīng)元件，這3個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)元件分別用羅馬數(shù)字Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ表示，體外凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)顯示生長(zhǎng)素響應(yīng)因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與這3個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)元件結(jié)合，以離起始密碼子最近的Ⅲ號(hào)元件的結(jié)合能力最強(qiáng)，因此我們推測(cè)AVB基因可能通過(guò)啟動(dòng)子上的生長(zhǎng)素響應(yīng)元件參與葉片發(fā)育過(guò)程中生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的原形成層分化過(guò)程。
　　7. AVB基因的蛋白功能分析
　　AVB蛋白含有988個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)

11、Phytozome網(wǎng)站上提供的信息，水稻中AVB家族蛋白共有5個(gè)。雖然NCBI網(wǎng)站上提供的注釋信息認(rèn)為AVB蛋白是功能未知且沒(méi)有保守結(jié)構(gòu)域，但根據(jù)全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)提供的信息，AVB蛋白屬于Armadillo-type fold蛋白家族，ARM類折疊（Armadillo-type fold）是由兩層α螺旋組成的右手超螺旋結(jié)構(gòu)，一般用于介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用。對(duì)AVB的同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)AVB在陸生植物界是保守的，且功能都

12、沒(méi)有過(guò)報(bào)道。
　　為了進(jìn)一步獲得水稻植株內(nèi)AVB蛋白產(chǎn)物的分布情況，我們采用western blot分析了在水稻植株的不同部位，AVB蛋白的存在情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AVB蛋白質(zhì)只存在于莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)部位且avb突變體中AVB蛋白完全缺失。AVB蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示AVB蛋白產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。
　　考慮到avb突變體地上器官橫切面上細(xì)胞數(shù)目減少，我們推測(cè)avb突變體的細(xì)胞分裂過(guò)程可能受到了AVB蛋白缺失的影響。采用流式細(xì)胞

13、儀分析野生型和突變體生長(zhǎng)點(diǎn)部位細(xì)胞的染色體倍性，發(fā)現(xiàn)突變體生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞的四倍體比例明顯低于野生型的，這說(shuō)明相對(duì)于野生型，突變體處于S期的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞分裂過(guò)程確實(shí)受到了AVB蛋白缺失的影響。histone H4作為染色體的組成成分，特異地在處于G1-S期的細(xì)胞中表達(dá)，采用原位雜交考察野生型和突變體過(guò)SAM橫切面上histone H4基因的表達(dá)情況進(jìn)一步證明了AVB蛋白維持著生長(zhǎng)點(diǎn)區(qū)域干細(xì)胞細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行。不同于葉原基部位his

14、tone H4基因表達(dá)頻率降低，在幼嫩葉鞘的原形成層細(xì)胞中，histone H4基因的表達(dá)頻率明顯增高，暗示相對(duì)于野生型，突變體原形成層細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力，這也解釋了為什么在突變體中，維管束面積增大。
　　8. avb突變體的轉(zhuǎn)錄組分析
　　為了獲得由AVB基因突變所造成的突變體轉(zhuǎn)錄組水平上的變化情況，在分蘗后期，提取野生型和avb突變體的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)部位的總RNA進(jìn)行RNA-Seq，每個(gè)材料設(shè)置了3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)

15、。通過(guò)RNA-Seq共篩選到730個(gè)在野生型和突變體中差異表達(dá)的基因，其中678個(gè)基因在avb突變體中表達(dá)上調(diào)，52個(gè)基因下調(diào)。使用AgriGo網(wǎng)站對(duì)篩選到的差異基因進(jìn)行g(shù)ene ontology（GO）富集分析。GO富集結(jié)果顯示參與多細(xì)胞器官發(fā)育過(guò)程（GO：0007275）的基因受到AVB基因突變的強(qiáng)烈影響：水稻中參與這一過(guò)程的基因共有45個(gè)，其中44個(gè)基因的表達(dá)水平都發(fā)生了不同程度的改變：36個(gè)基因的表達(dá)明顯上調(diào)，8個(gè)基因的表達(dá)水平