豬胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測(cè)和分型系統(tǒng)的建立及應(yīng)用.pdf

1、1 胸膜肺炎放線桿菌三種PCR檢測(cè)方法的評(píng)估 血清學(xué)診斷方法是常用的App檢測(cè)手段，但該法應(yīng)用受到許多方面的限制。近15年來(lái)，App PCR檢測(cè)方法已有許多報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)特異性實(shí)驗(yàn)、敏感性實(shí)驗(yàn)、樣品的直接檢測(cè)等方面，對(duì)從已報(bào)道的PCR方法中篩選出的3種即apx-PCR、omlA-PCR、epx-PCP進(jìn)行了比較，并確定cpx-PCR作為較適合本實(shí)驗(yàn)室的最佳檢測(cè)方法。 2 胸膜肺炎放線桿菌PCR快速分型系統(tǒng)的建立及初步臨

2、床應(yīng)用 根據(jù)外膜蛋白基因中間部分的差異，毒素基因和莢膜基因的型特異性，建立3個(gè)多重PCR的分型體系，可將App1～12型分成11個(gè)模式，除9型和11型外完全區(qū)分。此分型體系用于臨床分離株JS3，ZJ5和JS7的分型，得出的結(jié)果和血清學(xué)分型一致。對(duì)人工發(fā)病豬扁桃體和肺臟各12份，鼻拭子8份，-20℃保存一年的人工發(fā)病豬扁桃體和肺臟各3份分型結(jié)果與已知血清型一致。從20份臨床可疑病料中檢測(cè)出2份陽(yáng)性，均為7型。從健康豬扁桃體250份

3、中檢測(cè)出3份陽(yáng)性，一份為4型，一份為12型，一份為3型。 3 豬胸膜肺炎放線桿菌毒素Ⅰ和Ⅲ基因的串連表達(dá)及序列分析 參照GenBank中的App血清8型和10型菌株序列分別設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，用PCR方法擴(kuò)增毒素Ⅰ(ApxⅠ)基因5’端部分基因，得到1047bp的片段，毒素Ⅲ(ApxⅢ)基因3，端部分基因，得到868bp的片段，然后重疊延伸剪切術(shù)(SOE)將兩段PCR產(chǎn)物連接，將連接產(chǎn)物(apxⅠ-apxⅢ)克隆到pM