人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的初步探討.pdf

1、目的:探索獲取肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的方法并觀察其生物學(xué)特性及腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況。
　　方法:
　　1、收集采用普通培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)與采用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞。
　　2、在倒置顯微鏡下觀察兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。
　　3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90、CD1

2、33、CD24的各自表達(dá)量。
　　4、SYBR GreenⅠ Real-Time PCR方法檢測(cè)兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90、CD133、CD24對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)水平的變化情況。
　　5、將兩種培養(yǎng)方法處理后的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞各自注射入不同的裸鼠皮下，觀察并記錄種植瘤的體積，依此比較兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤細(xì)胞的致瘤能力及體內(nèi)增殖能力。
　

3、　結(jié)果:
　　1、兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　倒置顯微鏡下觀察到貼壁培養(yǎng)的SMMC-7721腫瘤細(xì)胞呈鋪路石樣生長(zhǎng)，排列規(guī)整。而懸浮培養(yǎng)后SMMC-7721腫瘤細(xì)胞逐漸由單細(xì)胞聚集、增殖成球狀或類球狀。
　　2、應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90、CD133、CD24的各自表達(dá)量比較。
　　結(jié)果顯示:懸浮培養(yǎng)組中CD90(571.77±8.70)、CD24(233.56

4、±10.85)的表達(dá)量明顯高于貼壁培養(yǎng)組(19.15±0.54、17.37±0.15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CD90 t=-109.80 P=0.00; CD24 t=-34.51 P=0.00)，但CD133在懸浮培養(yǎng)組(1.42±0.61)與貼壁培養(yǎng)組(1.48±1.09)中的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.08 P=0.94)。
　　3、兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90、CD133、CD24對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)水平的

5、變化情況。
　　3.1 RNA的鑒定
　　紫外線下觀察可見有兩條明亮的條帶，分別對(duì)應(yīng)于28S和18S RNA，另外有一條較暗淡的5S條帶。28S和18S條帶的光密度值之比約為(1.5～2)∶1，并且未見RNA彌散帶，表明RNA完整性良好。
　　3.2mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果
　　Real-Time PCR結(jié)果顯示，CD90、CD24、CD133基因均有擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線均進(jìn)入平臺(tái)期，熔解曲線呈標(biāo)準(zhǔn)的單峰，無雜峰出現(xiàn)，表明

6、擴(kuò)增產(chǎn)物特異。若貼壁培養(yǎng)組mRNA的表達(dá)量設(shè)定為1，則懸浮培養(yǎng)組的CD90、CD24、CD133mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.72±0.19、1.72±0.19、1.05±0.03。兩組相比，懸浮培養(yǎng)后細(xì)胞的腫瘤表面標(biāo)志物CD90、CD24的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于貼壁培養(yǎng)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CD90 t=-6.55 P=0.02，CD24 t=-6.71 P=0.00)，而貼壁培養(yǎng)組的CD133mRNA表達(dá)量相比懸浮培養(yǎng)組的無明顯

7、差異(t=-3.41 P=0.08)。
　　4、比較兩種培養(yǎng)方法處理后腫瘤細(xì)胞致瘤性及體內(nèi)增殖能力。
　　根據(jù)隔天測(cè)量皮下注射兩種方法培養(yǎng)的SMMC-7721的裸鼠腫瘤長(zhǎng)(a，單位mm)、寬(b，單位mm)，按ab2/2計(jì)算出的體積(V，單位mm3)大小（貼壁培養(yǎng)組腫瘤細(xì)胞裸鼠皮下注射后2天:71.23±51.44，4天:60.08±24.33,6天:45.14±15.24,8天:32.56±10.16,10天:31.73±

8、7.01，12天:26.41±13.95，14天:26.95±14.14;懸浮培養(yǎng)組腫瘤細(xì)胞裸鼠皮下注射后2天:60.17±47.93，4天:41.09±19.37，6天:32.90±14.13,8天:74.87±27.54,10天:97.30±37.63,12天:209.06±138.40，14天:294.69±250.65)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示兩組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.76，P=0.01)，說明兩組皮下腫瘤致瘤性及體內(nèi)增殖能

9、力有差別。而測(cè)量時(shí)間與培養(yǎng)方式之間存在交互作用(F=6.18，P=0.03)，隨著測(cè)量時(shí)間的延長(zhǎng)，懸浮培養(yǎng)組所致的皮下腫瘤體積變化趨勢(shì)呈從開始注射后2天到注射后6天為減小(2天:60.17±47.93，4天:41.09±19.37，6天:32.90±14.13)，6天后大幅增高(8天:74.87±27.54，10天:97.30±37.63,12天:209.06±138.40,14天:294.69±250.65),貼壁培養(yǎng)組皮下腫瘤體積變

10、化趨勢(shì)則呈緩慢減小后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)（2天:71.23±51.44,4天:60.08±24.33,6天:45.14±15.24,8天:32.53±10.16,10天:31.73±7.01,12天:26.41±13.95,14天:26.95±14.14)。說明懸浮培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增值能力強(qiáng)于貼壁培養(yǎng)的。且貼壁培養(yǎng)組編號(hào)4的裸鼠在皮下注射腫瘤細(xì)胞14天內(nèi)皮下腫瘤體積逐漸縮小至未觸及，結(jié)果提示懸浮培養(yǎng)組比貼壁培養(yǎng)組致瘤性更強(qiáng)。

11、　　結(jié)論:
　　1、懸浮培養(yǎng)后人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721部分細(xì)胞獲得了與腫瘤干細(xì)胞相似的部分特性，即為肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。
　　2、經(jīng)過懸浮培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721腫瘤細(xì)胞中表達(dá)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90、CD24的量明顯比貼壁培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞多，且所對(duì)應(yīng)的mRNA相對(duì)表達(dá)量也是相應(yīng)增高的。但CD133及其對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)效果在兩種培養(yǎng)方法的腫瘤細(xì)胞中無明顯差別。因此，懸浮培養(yǎng)后的人肝癌細(xì)胞株SMMC-