雷帕霉素滴眼劑抑制大鼠高危角膜移植排斥反應(yīng)的實驗研究.pdf

1、【研究背景】 角膜移植是眼科重要的復(fù)明手術(shù)，是成功率最高的同種異體組織器官移植。在低危險植床上進(jìn)行角膜移植，無其它并發(fā)癥，聯(lián)合局部使用免疫抑制劑，成功率高達(dá)90％；而在高危角膜移植中，排斥率仍然高達(dá)70％，免疫排斥仍是導(dǎo)致角膜移植失敗的最主要原因。角膜移植的高危因素包括：角膜新生血管，大植片，偏中心移植以及曾接受其它組織器官移植等，其中角膜新生血管是最常見的高危因素。高危角膜移植術(shù)后，免疫排斥發(fā)生率高，臨床治療棘手，患者生活和視

2、覺質(zhì)量差，因此抑制高危角膜移植術(shù)后的排斥反應(yīng)一直是眼科研究的熱點。目前臨床上預(yù)防和治療高危角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的方法有：全身和局部使用免疫抑制劑、組織配型等，最為常用的仍然是激素類藥物、環(huán)孢霉素A以及他克莫司等。眼科臨床迫切需要能局部應(yīng)用的高效低毒的免疫抑制藥物。 雷帕霉素，又名西羅莫司，是1975年發(fā)現(xiàn)的一種抗真菌抗生素，1978年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其對于自身免疫性疾病有治療作用，因而開始將其作為新型免疫抑制劑研究。目前雷帕霉素的

3、研究熱點主要集中在抗移植免疫排斥反應(yīng)以及預(yù)防心血管支架植入術(shù)后的再狹窄等方面。研究證明全身使用雷帕霉素可以有效抑制腎臟、肝臟、皮膚以及心臟等器官移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)，應(yīng)用于角膜移植同樣有效，但是對雷帕霉素眼用劑型的研究卻相對滯后，因此，我們將雷帕霉素制成滴眼劑，觀察雷帕霉素滴眼劑的角膜毒性作用，研究局部應(yīng)用雷帕霉素滴眼劑抑制角膜新生血管的作用，及其預(yù)防高危角膜移植排斥反應(yīng)的效果，并探討其可能的機制。 第一部分雷帕霉素滴眼劑對大

4、鼠角膜毒性的實驗研究 【目的】 研究雷帕霉素滴眼劑對大鼠角膜的毒性，探討雷帕霉素滴眼劑局部使用的安全濃度，為雷帕霉素滴眼劑在角膜移植中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 【方法】 無菌條件下將雷帕霉素溶于滅菌藥用蓖麻油中，分別制成0.5％、1％以及2％濃度的雷帕霉素滴眼劑。SPF級雄性SD大鼠15只，隨機分為生理鹽水對照組、藥用蓖麻油組、0.5％雷帕霉素組、1％雷帕霉素組及2％雷帕霉素組。各組大鼠均雙眼用藥，每日6次，每次

5、1滴，連續(xù)7d。每日對大鼠角膜行裂隙燈顯微鏡檢查并臨床分級，7d后摘取角膜行組織學(xué)檢查，并于透射電鏡下觀察角膜各層超微結(jié)構(gòu)的變化。 【結(jié)果】 生理鹽水對照組、藥用蓖麻油組、0.5％雷帕霉素組以及1％雷帕霉素組角膜裂隙燈顯微鏡檢查未見異常，臨床分級為0級，組織學(xué)檢查及透射電鏡檢查未見明顯異常；2％雷帕霉素組第4日裂隙燈顯微鏡下見角膜輕度水腫，臨床分級為1級，繼續(xù)用藥未見損害加重，組織學(xué)檢查見角膜上皮基底細(xì)胞層排列紊亂，細(xì)胞

6、極性消失，透射電鏡見上皮層細(xì)胞間隙擴大，細(xì)胞腫脹，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，胞漿內(nèi)大量糖原顆粒。 【結(jié)論】 結(jié)論：以蓖麻油為基質(zhì)的0.5％、1％濃度雷帕霉素滴眼劑對大鼠角膜無明顯毒性作用；蓖麻油作為滴眼劑基質(zhì)是安全的。 第二部分雷帕霉素滴眼劑抑制大鼠角膜血管化的實驗研究 【目的】 研究雷帕霉素滴眼劑抑制大鼠角膜新生血管生長情況，探討其抑制新生血管的機制。 【方法】 角膜縫線法

7、建立SD大鼠左眼角膜新生血管模型12只，隨機分為生理鹽水對照組以及1％雷帕霉素滴眼劑組。各組均術(shù)后第1日開始用藥，每日4次，每次l滴。每日行裂隙燈顯微鏡檢查，術(shù)后第3日、7日、14日用游標(biāo)卡尺測量角膜新生血管的長度，計算新生血管面積。14d后切取角膜行組織學(xué)檢查，并采用免疫組織化學(xué)染色法檢測血管內(nèi)皮生長因子以及白介素2受體α的表達(dá)。 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包分析，所得數(shù)據(jù)以(x±s)表示，采用定量數(shù)據(jù)重復(fù)測量的方差分析，以

8、P<0.05表示在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。 【結(jié)果】 生理鹽水對照組角膜新生血管面積顯著高于1％雷帕霉素滴眼劑組(F=292.507，P=0.000)；從不同時間點看，生理鹽水對照組角膜新生血管面積均高于1％雷帕霉素治療組(t值分別為11.614,8.403，12.638；P值均為0.000)。生理鹽水對照組血管內(nèi)皮生長因子在角膜上皮層、淺基質(zhì)層、新生血管內(nèi)皮、角膜縫線處上皮以及浸潤的炎性細(xì)胞出現(xiàn)陽性表達(dá)；白介素2受體α在

9、角膜上皮層、淺基質(zhì)層、內(nèi)皮、新生血管內(nèi)皮、炎性浸潤細(xì)胞上均有強表達(dá)。1％雷帕霉素滴眼劑組血管內(nèi)皮生長因子在新生血管內(nèi)皮、角膜縫線處以及浸潤的炎性細(xì)胞出現(xiàn)陽性表達(dá)；白介素2受體α在角膜內(nèi)皮、血管內(nèi)皮、炎性浸潤細(xì)胞上弱表達(dá)。 【結(jié)論】 1％雷帕霉素滴眼劑抑制角膜新生血管生長。1％雷帕霉素滴眼劑可能通過降低血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)以及抑制炎性細(xì)胞的分化浸潤從而抑制新生血管的生長。 第三部分雷帕霉素滴眼劑抑制大鼠高危角膜移

10、植排斥反應(yīng)的實驗研究 【目的】 研究1％雷帕霉素滴眼劑抑制大鼠高危角膜移植免疫排斥反應(yīng)的效果；并初步觀察其與環(huán)孢素A滴眼液聯(lián)合用藥的效果，為臨床防治高危角膜移植排斥反應(yīng)提供更加合理、有效的用藥方案。 【方法】 縫線法誘導(dǎo)SD大鼠左眼角膜新生血管成功后，行以Wistar大鼠為供體的穿透性角膜移植術(shù)。將手術(shù)后的受體大鼠隨機分為生理鹽水組、1％環(huán)孢素A組、1％雷帕霉素組以及1％環(huán)孢素A和1％雷帕霉素聯(lián)合用藥組，

11、每組8只。每組均于術(shù)后第1日開始用藥，每日4次，每次1滴；每日觀察角膜移植物混濁、水腫以及新生血管情況，比較各組植片的存活時間。 采用SPSS10.0分析。計量資料以(x±s)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較當(dāng)滿足方差齊性要求時用LSD，如不滿足方差齊性要求時用Tambane'sT2，以P<0.05表示在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。 【結(jié)果】 各組植片的平均存活時間依次為：7.9d、11.3d、13.6d、16.