棉花轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY23基因的分離及功能分析.pdf

1、棉花在其生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭受各種逆境脅迫，包括生物脅迫（黃萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌和植食性昆蟲咬食等）和非生物脅迫（干旱、高鹽等），對棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量造成一定的不利影響。培育抗病抗逆新品種是解決棉花病害問題的有效途徑，而這依賴于其抗病抗逆分子機(jī)制的研究。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)調(diào)控在植物抵御外界脅迫中起著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子，如DREB、NAC、WRKY、MYB等，在響應(yīng)逆境脅迫反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。分離、鑒定參與逆境脅迫應(yīng)答的

2、轉(zhuǎn)錄因子并開展其功能研究是揭示植物抗病及抗逆分子機(jī)制的重要途徑。鑒于此，本研究以陸地棉為材料，利用同源克隆與RACE PCR的方法分離得到一個(gè)II類WRKY基因，同時(shí)對該基因進(jìn)行了序列特征分析、表達(dá)特性分析及生物學(xué)功能鑒定，主要結(jié)果如下：
　?。?）序列分析表明，GhWRKY23 cDNA全長1194bp，包括121bp的5'UTR，125bp的3'UTR和948bp的開放閱讀框。該ORF編碼一個(gè)含有315個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測其分

3、子量約為35.6kDa，等電點(diǎn)為5.94?；蚪M序列分析、同源序列比對和蛋白聚類分析表明，GhWRKY23屬于IIc類WRKY蛋白轉(zhuǎn)錄因子。
　?。?）亞細(xì)胞定位分析表明GhWRKY23定位在細(xì)胞核中，推測該基因在細(xì)胞核中發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。
　　（3）qRT-PCR分析棉花幼苗中GhWRKY23基因的表達(dá)模式，結(jié)果表明干旱、機(jī)械損傷和氧化脅迫能上調(diào)GhWRKY23的表達(dá)，而高鹽、青枯勞爾氏菌和立枯絲核菌則抑制它的表達(dá)。此

4、外，一些病程相關(guān)信號(hào)分子如SA、MeJA、ABA、ET在不同程度上誘導(dǎo)了GhWRKY23的表達(dá)。以上結(jié)果表明GhWRKY23能夠響應(yīng)多種非生物和生物脅迫，并可能受多種信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，初步推測其可能在防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　（4）構(gòu)建GhWRKY23正義植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌侵染的方法獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因本生煙植株。對超表達(dá)植株的種子進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)和根長統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明GhWRKY23對SA和ET敏感，對ABA有一定的抗性。推測

5、該基因能參與到SA、ABA和ET介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中。
　?。?）GhWRKY23超表達(dá)植株離體葉片接種煙草青枯勞爾氏菌、丁香假單胞菌番茄致病變種和立枯絲核菌后，相對野生型植株表現(xiàn)出明顯的感病癥狀。DAB染色和臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果進(jìn)一步表明超表達(dá)植株中積累了更多ROS并產(chǎn)生了更多壞死組織，MDA含量測定結(jié)果說明超表達(dá)植株細(xì)胞膜損傷情況更嚴(yán)重。同時(shí)用MV模擬氧化脅迫，在轉(zhuǎn)基因的葉片中觀察到更多的活性氧積累。推測該基因可能在抵御病原菌侵染中

6、起到負(fù)調(diào)控作用，并可能參與到氧化脅迫響應(yīng)中。
　　（6）利用qRT-PCR技術(shù)，對接種病原菌后前后SA、ABA、JA、ET信號(hào)通路中抗病相關(guān)基因及其他病程相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株中的有些基因表達(dá)量較野生型植株有明顯的下調(diào)趨勢，推測GhWRKY23可能通過抑制SA、JA/ET信號(hào)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)來負(fù)調(diào)控抗病反應(yīng)。
　?。?）利用qRT-PCR分析病原菌侵染前后活性氧產(chǎn)生及清除相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示超表達(dá)