EGCG對(duì)ConA致小鼠肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、前言
　　免疫反應(yīng)導(dǎo)致的肝損傷是諸多肝臟疾病如:自身免疫性肝炎(AIH)、病毒性肝炎，酒精性肝病等疾病發(fā)展的重要因素，T細(xì)胞在其中起到了重要的作用。刀豆蛋白A(ConA)誘發(fā)的小鼠急性肝損傷是由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性肝損傷模型，該模型具有較強(qiáng)的器官特異性，與人類的自身免疫性肝炎(AIH)、病毒性肝炎等疾病相似，常用來研究上述肝細(xì)胞損傷的分子生物學(xué)機(jī)制及觀察藥物的療效。炎性因子在刀豆蛋白A(ConA)誘發(fā)的小鼠急性肝損傷過程中起到了至關(guān)

2、重要的作用，有研究發(fā)現(xiàn)，在ConA誘導(dǎo)的肝損傷模型中，炎性因子的表達(dá)明顯增高。核因子κB(NF-κB)是細(xì)胞內(nèi)重要的參與炎癥反應(yīng)的分子，當(dāng)細(xì)胞接收來自細(xì)胞外的刺激時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB會(huì)由原先受IκB抑制的狀態(tài)下釋放出來，并呈現(xiàn)活化狀態(tài)，活化之后的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核中并調(diào)控下游炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的表達(dá)，從而參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生。目前已經(jīng)明確Toll樣受體可以通過激活NF-κB信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)過程，以往大量的研究表明TLR2，TLR

3、4和TLR9信號(hào)通路的激活在ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷中有著舉足輕重的作用。此外有研究證明，TLR2或TLR4的基因敲除減輕了ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷。由于TLR在ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷中的重要作用，TLR被認(rèn)為是T細(xì)胞介導(dǎo)的肝損傷的潛在治療靶點(diǎn)。
　　表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是從綠茶中提取的一種多酚化合物，大量的研究表明EGCG具有抗炎、抗氧化，抗癌等諸多藥理活性

4、，有研究發(fā)現(xiàn)，EGCG通過降低致炎因子及纖維化調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而達(dá)到抑制CCL4誘導(dǎo)的肝炎的氧化應(yīng)激及纖維化的作用。最近有結(jié)果顯示EGCG能夠通過抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)減輕ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷。然而EGCG減輕ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷及其抗炎的相關(guān)生物學(xué)分子生物學(xué)機(jī)制仍不十分清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建conA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，給予EGCG進(jìn)行干預(yù)，探討EGCG是否有保護(hù)肝臟的作用及其作用機(jī)制，為治療免疫性肝損傷提供新

5、的理論依據(jù)和方法。
　　材料與方法
　　一、材料
　　雄性C57BL/6小鼠，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、EGCG對(duì)照組、conA模型組，EGCG+conA模型組。EGCG對(duì)照組和EGCG+ConA模型組經(jīng)灌胃給予5mg/kg的EGCG，每天兩次，共10天，正常對(duì)照組和ConA模型組同時(shí)給予等體積的PBS;10天后，ConA模型組和EGCG+ConA模型組的小鼠經(jīng)尾靜脈注射15mg/kg的

6、ConA，正常對(duì)照組和EGCG對(duì)照組同時(shí)給予等體積的PBS，分別于注射0h、10h、20h、30h時(shí)取各組小鼠外周血并處死取肝組織。
　　二、方法
　　小鼠麻醉后眼球取血，離心后ELISA檢測(cè)ALT和AST的水平。
　　檢測(cè)各組小鼠肝組織中SOD、MDA及GSH的含量。
　　小鼠肝組織一部分經(jīng)4％的多聚甲醛固定后，用石蠟包埋，切片后HE染色，觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變。
　　Western-blot法檢測(cè)IκBα

7、和p-IκBα及NF-κB的表達(dá)及TLA2、TLA4和TLA9蛋白的表達(dá);EMSA法檢測(cè)NF-κB的結(jié)合活性。
　　小鼠肝組織用免疫組化方法檢測(cè)TLA2、TLA4和TLA9的表達(dá)。Real-timePCR法檢測(cè)炎性因子TNF-α，IFN-γ和IL-10及TLA2、TLA4和TLA9的mRNA的表達(dá)情況。
　　三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　統(tǒng)計(jì)資料采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分

8、析，進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　一、各組小鼠肝組織的病理變化
　　HE染色顯示:正常對(duì)照組和EGCG對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞無水腫，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)正常，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn);conA模型組造模10h后出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著時(shí)間的推移，損傷逐漸加重，于20h達(dá)峰值;EGCG+ConA模型組肝臟病理損傷較conA模

9、型組明顯減輕。
　　二、EGCG對(duì)ConA誘導(dǎo)的肝損傷小鼠轉(zhuǎn)氨酶及氧化應(yīng)激的影響
　　ConA模型組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶升高，于注射20h時(shí)達(dá)高峰，EGCG治療后數(shù)值明顯下降。MDA在conA模型組小鼠肝組織中含量增多，而SOD和GSH的含量下降;EGCG治療后上述數(shù)值均趨于正常。
　　三、EGCG對(duì)小鼠肝組織中炎性指標(biāo)（TNF-α，IFN-γ和IL-10）及NF-κB的影響
　　Realtime-PCR結(jié)果顯示:

10、r>　　ConA模型組小鼠TNF-α，IFN-γ和IL-10表達(dá)較正常對(duì)照組和EGCG對(duì)照組明顯升高，EGCG治療后三者表達(dá)均顯著下降。
　　Westernblot結(jié)果顯示:
　　正常對(duì)照組和EGCG對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)少許NF-κB表達(dá)，兩者無明顯差異;conA模型組小鼠NF-κB的表達(dá)明顯增多，而EGCG治療后其表達(dá)顯著減少。
　　EMSA結(jié)果顯示:
　　ConA模型組NF-κB結(jié)合活性較對(duì)照組明顯升高，EGCG治

11、療組活性顯著下降。
　　四、EGCG對(duì)小鼠肝組織中TLR2、TLR4和TLR9表達(dá)的影響
　　免疫組化結(jié)果顯示:
　　TLR2、TLR4和TLR9在正常對(duì)照組和EGCG對(duì)照組的胞漿內(nèi)較少表達(dá)，ConA模型組三者的陽性表達(dá)明顯增多，EGCG治療后其表達(dá)顯著下降。
　　Westernblot結(jié)果顯示:正常對(duì)照組和EGCG對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)少許表達(dá)，ConA模型組小鼠的表達(dá)明顯增多，而EGCG治療后其表達(dá)顯著減少。

12、　　Realtime-PCR結(jié)果顯示:ConA模型組小鼠TLR2、TLR4和TLR9mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組和EGCG對(duì)照組明顯升高，EGCG治療后三者表達(dá)均顯著下降。
　　結(jié)論
　　1、ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型的肝組織中TNF-α，IFN-γ和IL-10均高表達(dá)，EGCG治療后上述炎性指標(biāo)顯著下降。
　　2、NF-κB在ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中高表達(dá)，且結(jié)合活性增高;EGCG治療后可以使NF-κB表