胸腺肽a1對白血病細(xì)胞吲哚胺2,3-加雙氧酶蛋白表達(dá)及免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下兩部分展開論述：
　　第一部分 目的：探討胸腺肽α1( thymosin alpha-1,Tα1)對IFN-γ誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞吲哚胺2,3-加雙氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)蛋白表達(dá)的影響及其機制。方法：1.細(xì)胞的培養(yǎng):實驗分為IFN-γ/Ta1抑制IDO表達(dá)及IFN-γ/Ta1下調(diào)IDO表達(dá)組,再對每組進行不同濃度及時間的處理。2.將獲得的細(xì)胞裂解后再純化蛋白,并檢測細(xì)胞內(nèi)所含

2、有的總蛋白。3.Western Blot方式探查每一個組分蛋白含量的變化。4.ECL充分浸泡,熒光檢測儀看結(jié)果。結(jié)果：1.未加入IFN-γ時,IDOmRNA圖譜上可見微弱顯示,IDO蛋白印跡在圖譜上未見明顯顯示,IFN-γ誘導(dǎo)后,IDO蛋白印跡圖譜上條帶顯示明顯增強。2.IFN-γ誘導(dǎo)后,加入Ta1作用,IDO蛋白條帶隨著Ta1濃度的增強及和作用時間的增長明顯減弱,其圖譜所得像素值也可說明。3.當(dāng)IFN-γ/Ta1同時作用于HL-60與

3、K562細(xì)胞后,IDO蛋白條帶同樣隨著Ta1濃度的增強及和作用時間的增長明顯減弱,提示Ta1能夠削弱干擾素對IDO的干擾效果,產(chǎn)生的數(shù)量有所減少。結(jié)論：1.一般情況下,IDO在HL-60及K562細(xì)胞中呈現(xiàn)低水平表達(dá),而IDO作為一種免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子,是可以約束色氨酸分解的特殊作用的酶劑,而色氨酸逐漸的減少會引發(fā)T細(xì)胞的繁殖的減弱和死亡的機率大幅增多,從而導(dǎo)致免疫耐受,因此提示IDO的表達(dá)可能與白血病的免疫耐受機制有緊密的關(guān)系。2.干擾素

4、-γ能使細(xì)胞的IDO產(chǎn)生數(shù)量變得很多。干擾素影響后,IDO大幅增強,提示IFN-γ的運用可能會促進腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的大量增長,但是IFN-γ是一種特殊的Th1因子,能對機體的功能產(chǎn)生很大的影響,尤其是在免疫方面,因此在IFN-γ在用于一些患者的診療時,應(yīng)警惕其對免疫方面形成的刺激作用。3.胸腺肽 al可以很明顯的降低IDO的含量。IFN-γ誘導(dǎo)后HL-60與K562細(xì)胞IDO蛋白表達(dá)增強,當(dāng)Ta1作用后,IDO蛋白表

5、達(dá)呈濃度依賴性和時間依賴性下調(diào),提示Ta1可以下調(diào)細(xì)胞IDO產(chǎn)生的數(shù)目。4.Ta1阻礙了IDO的大量的產(chǎn)生。IFN-γ/Ta1同時作用于HL-60與K562細(xì)胞后,IDO蛋白表達(dá)減弱,提示Ta1能夠削弱IFN-γ對IDO的誘導(dǎo)作用,使其表達(dá)降低。Ta1作為一種生物免疫的反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,對白血病細(xì)胞IDO蛋白產(chǎn)生的阻礙作用為疾病的免疫治療創(chuàng)造了新的發(fā)展方向。
　　第二部分 胸腺肽al下調(diào)HL-60及k562細(xì)胞IDO對T細(xì)胞發(fā)育的影響。

6、
　　目的：研究Ta1下調(diào)IDO+HL-60/K562細(xì)胞對T細(xì)胞的干擾影響和相關(guān)通路。方法：1.IFN-γ誘導(dǎo)HL-60及K562細(xì)胞:IFN-γ(1000IU/ml)誘導(dǎo)HL-60及K562細(xì)胞72小時。2.已經(jīng)經(jīng)過藥物處理的腫瘤細(xì)胞和PBL的聯(lián)合孵育:實驗分為①Hγ/kγ-MlR-PHA組;②Hγ/kγ-MlR-PHA+Ta1組;③Hγ/kγ-MlR-PHA+1-MT組,分別對三組進行藥物誘導(dǎo)72小時。3.最后運用MTT來驗

7、證Ta1對T細(xì)胞的生長是否有降低影響:與MTT聯(lián)合處理5h后停止培養(yǎng),再小心添進DMSO充分混合直至完全溶解。4.用酶聯(lián)測試機器630納米檢測OD數(shù)字并分析數(shù)據(jù)。結(jié)果：1.PHA與惡性細(xì)胞形狀及數(shù)量的增長都無大量作用。2.PHA能明顯使 T細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)改變。電鏡下觀察PHA干擾后所生成的的T細(xì)胞數(shù)量變得更多。3.實驗結(jié)果:Hγ/kγ-MlR-PHA組較 Hγ/kγ-MlR-PHA+Ta1組與 Hγ/kγ-MlR-PHA+1-MT組對

8、T淋巴細(xì)胞的抑制作用更加明顯,生長率降低,與陽性及陰性組(PHA+T、T)相比照,有意義(p<0.05)。結(jié)論：1.PHA與惡性細(xì)胞的混合對實驗結(jié)果沒有太大的干擾,表明PHA與白血病細(xì)胞的混合培養(yǎng)對實驗結(jié)果無影響。2.PHA大幅使T細(xì)胞的數(shù)量變多,PHA處理后可見T細(xì)胞的數(shù)量大幅增多,體積增大,有較大集落形成,形成淋巴母細(xì)胞群。3.Ta1可以減少IDO對T細(xì)胞的數(shù)量的增長的阻礙影響。PHA處理后,T細(xì)胞的數(shù)目大幅的提高,加入惡性細(xì)胞后,