基于紅細(xì)胞溶血貧血探討地中海貧血患者證候季節(jié)變化的分子機(jī)制.pdf

1、背景:
　　地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）是由于珠蛋白基因突變或缺失導(dǎo)致珠蛋白合成障礙的一組遺傳性溶血性貧血，其中最常見的是α-地貧和β-地貧。地貧至今仍無有效的治療辦法。導(dǎo)師吳志奎教授課題組，根據(jù)中醫(yī)“腎藏精生髓、髓生血”經(jīng)典理論，從腎論治治療地貧，經(jīng)過三十多年的臨床實(shí)踐，首次對(duì)中醫(yī)藥治療地貧從理論基礎(chǔ)、核心病機(jī)、治則治法、作用特點(diǎn)和可能機(jī)制等提出了較明確的理論認(rèn)識(shí)，形成了系統(tǒng)的理論與有效治法，取得了領(lǐng)先的臨床研究成果。通過系列的臨床和

2、實(shí)驗(yàn)研究，驗(yàn)證了“腎生髓、髓生血”理論指導(dǎo)地貧臨床治療的有效性和科學(xué)性。
　　本課題組2006年對(duì)112例中間型地貧患者進(jìn)行中醫(yī)證候調(diào)查，發(fā)現(xiàn)地貧患者中醫(yī)證候多為肝腎陰虛，精血不足證，病情嚴(yán)重程度與季節(jié)變化有關(guān)，即夏季溶血貧血嚴(yán)重，冬季有所緩解，其證候變化的特點(diǎn)是基本證型未變，但臨床癥狀有明顯的季節(jié)改變，這種證候季節(jié)變化，體現(xiàn)了中醫(yī)“天人合一，四時(shí)陰陽”的整體觀，這種證候季節(jié)變化可能與血液參數(shù)季節(jié)性改變有關(guān)。既往有關(guān)地貧患者證候季

3、節(jié)變化的臨床報(bào)道鮮有，尚未見地貧患者證候季節(jié)變化生物學(xué)機(jī)制研究的報(bào)道。本課題是依托國(guó)家自然科學(xué)基金和“973”研究課題，在前期發(fā)現(xiàn)和探索的基礎(chǔ)上，探討季節(jié)變化對(duì)地貧患者臨床證候的影響;從紅細(xì)胞溶血貧血的角度探討地貧患者證候季節(jié)變化的可能物質(zhì)基礎(chǔ);并進(jìn)一步從紅細(xì)胞溶血貧血的角度探討益髓生血顆粒治療地貧的療效可能機(jī)制。
　　目的:
　　以地貧患者為研究對(duì)象，從血液指標(biāo)和中醫(yī)證候量化評(píng)分兩個(gè)方面探討季節(jié)變化對(duì)地貧患者臨床表現(xiàn)的影響

4、;從紅細(xì)胞溶血貧血這一角度闡釋地貧患者證候季節(jié)變化的可能分子機(jī)制，探討證候季節(jié)變化與紅細(xì)胞溶血貧血的內(nèi)在關(guān)系，為中醫(yī)“四時(shí)”理論指導(dǎo)地貧臨床治療提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、地貧患者證候季節(jié)變化的臨床觀察以高發(fā)區(qū)地貧患者為研究對(duì)象，進(jìn)行了兩批次的臨床觀察。第一批次臨床觀察:在冬夏兩季分別選取一組HbH病患者，冬季組HbH病患者35例，夏季組HbH病患者31例，比較兩組HbH病患者血液指標(biāo)和中醫(yī)證候量化評(píng)分水平的差異

5、，初步探討季節(jié)變化對(duì)地貧患者臨床證候的影響。第二批次臨床觀察:選取11例地貧患者（5例α-地貧、6例β-地貧），對(duì)11例地貧患者進(jìn)行冬夏兩季的連續(xù)觀察，動(dòng)態(tài)檢測(cè)地貧患者冬夏兩季血液指標(biāo)水平并對(duì)中醫(yī)證候進(jìn)行量化評(píng)分，進(jìn)一步探討季節(jié)變化對(duì)地貧患者臨床證候的影響。
　　2、基于紅細(xì)胞溶血貧血探討地貧患者證候季節(jié)變化分子機(jī)制在臨床研究的基礎(chǔ)上，針對(duì)地貧患者紅細(xì)胞溶血和貧血的臨床特點(diǎn)，采用RT-PCR、ELISA、透射電鏡、比色法、比濁法、

6、WB法等分子生物學(xué)技術(shù)，研究冬夏兩季地貧患者紅細(xì)胞溶血和貧血相關(guān)指標(biāo)（血清鐵和血清鐵蛋白、紅細(xì)胞抗氧化損傷、紅細(xì)胞膜骨架蛋白mRNA表達(dá)、紅細(xì)胞包涵體含量、紅細(xì)胞膜相關(guān)離子通透酶、造血細(xì)胞因子）等水平的差異，從紅細(xì)胞溶血和貧血角度探討地貧患者證候季節(jié)變化的可能分子機(jī)制。
　　3、基于紅細(xì)胞溶血貧血探討益髓生血顆粒治療地貧的療效可能機(jī)制選取16例地貧患者，從地貧患者紅細(xì)胞溶血和貧血的角度探討治療前后珠蛋白鏈比、紅細(xì)胞抗氧化損傷水平、

7、紅細(xì)胞膜骨架蛋白mRNA表達(dá)、紅細(xì)胞膜相關(guān)酶活性、造血細(xì)胞因子活性、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA和蛋白表達(dá)、BCL11A mRNA的表達(dá)等指標(biāo)水平的變化，探討益髓生血顆粒治療地貧的療效可能的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、證候季節(jié)變化的臨床觀察
　　1)季節(jié)變化對(duì)HbH病患者證候影響的臨床觀察
　　冬季組HbH病患者主要血液指標(biāo)Hb水平顯著高于夏季組HbH病患者(P＜0.05)，冬季組HbH病患者Ret、HbH水平顯

8、著低于夏季組(P＜0.05)。冬夏兩組HbH病患者RBC水平無明顯差異。夏季組缺失型HbH病患者Hb水平顯著低于冬季組(P＜0.05);冬夏兩組非缺失型HbH病患者Hb水平比較無明顯差異。
　　冬季組HbH病患者面色萎黃、爪甲色淡、耳鳴、口咽干燥的中醫(yī)證候量化評(píng)分顯著低于夏季組(P＜0.01或P＜0.05);腰膝酸軟、潮熱盜汗中醫(yī)證候量化評(píng)分冬夏兩組無明顯差異。冬季組非缺失型HbH病患者面色萎黃、耳鳴、口咽干燥的中醫(yī)證候量化評(píng)分顯

9、著低于夏季組(P＜0.05或P＜0.01)。冬季組缺失型HbH病患者面色萎黃、爪甲色淡、腰膝酸軟、口咽干燥的中醫(yī)證候量化評(píng)分顯著低于夏季組(P＜0.05或P＜0.01)。冬季組HbH病患者中無論是非缺失型還是缺失型，其大多中醫(yī)證候量化評(píng)分均低于夏季組，提示夏季病情較重，冬季有緩解。初步說明了地貧患者臨床癥狀受季節(jié)變化的影響。
　　2)季節(jié)變化對(duì)同一組地貧患者證候影響的連續(xù)觀察
　　11例地貧患者冬季主要血液指標(biāo)Hb水平顯著高

10、于夏季(P＜0.05)，冬夏兩季RBC、Ret水平無明顯差異。11例地貧患者冬季爪甲色淡、食少納呆、潮熱盜汗的中醫(yī)證候量化評(píng)分顯著低于夏季(P＜0.05);頭暈?zāi)垦?、倦怠乏力、腰膝酸軟中醫(yī)證候量化評(píng)分冬夏兩季無明顯差異。同一組地貧患者冬夏兩季的連續(xù)觀察結(jié)果進(jìn)一步說明了地貧患者溶血貧血嚴(yán)重程度受季節(jié)變化的影響。
　　2、基于紅細(xì)胞溶血貧血探討地貧患者證候季節(jié)變化分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　1)冬夏兩季地貧患者SI、SF水平的檢測(cè)顯

11、示:夏季組HbH病患者SI、SF水平顯著高于冬季組(P＜0.05)。11例地貧患者冬季SI、SF水平與夏季水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有低于夏季水平的趨勢(shì)。
　　2)冬夏兩季地貧患者紅細(xì)胞抗氧化損傷水平檢測(cè)顯示:冬季組HbH病患者抗氧化損傷指標(biāo)SOD活性顯著低于夏季組(P＜0.05)，冬夏兩組HbH病患者M(jìn)DA含量和GSH-Px活性無明顯差異。11例地貧患者冬季SOD、GSH-Px活性顯著低于夏季(P＜0.01)，MDA的含量顯著

12、也低于夏季(P＜0.01)。
　　3)冬夏兩季地貧患者紅細(xì)胞包涵體含量檢測(cè)顯示:地貧患者夏季紅細(xì)胞包涵體的含量和比例明顯多于冬季。
　　4)冬夏兩季地貧患者紅細(xì)胞膜骨架蛋白mRNA表達(dá)水平檢測(cè)顯示:冬季組HbH病患者SPTA1、SPTB、EPB4.1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于夏季組(P＜0.01)。11例地貧患者冬季SPTA1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于夏季(P＜0.05)，SPTB、EPB4.1的mRNA表達(dá)水平冬夏兩季

13、無明顯差異。
　　5)冬夏兩季地貧患者造血細(xì)胞因子活性水平的檢測(cè)顯示:冬季組HbH病患者子SCF活性顯著高于夏季組(P＜0.05)。冬夏兩組HbH病患者IL-3活性水平無明顯差異。11例地貧患者冬季SCF、EPO活性水平顯著高于夏季(P＜0.05或P＜0.01)，IL-3活性水平顯著低于夏季(P＜0.05)。
　　6)冬夏兩季地貧患者紅細(xì)胞膜相關(guān)酶活性檢測(cè)顯示:冬季組HbH病患者Na+-K+-ATP酶、T-ATP酶活性顯著高

14、于夏季組(P＜0.05)，冬夏兩組HbH病患者Ca2+-Mg2+-ATP酶活性無明顯差異。11例地貧患者冬季Na+-K+-ATP酶、T-ATP酶活性顯著高于夏季(P＜0.01或P＜0.05)，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性冬夏兩季無明顯差異。
　　臨床實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:季節(jié)變化對(duì)地貧患者紅細(xì)胞溶血貧血相關(guān)指標(biāo)水平的影響，可能是地貧患者存在證候季節(jié)變化的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。
　　3、基于紅細(xì)胞溶血貧血探討益髓生血顆粒治療地貧的

15、療效可能機(jī)制
　　3.1益髓生血顆粒治療16例地貧患者（8例α-地貧、8例β-地貧）的臨床觀察
　　1)經(jīng)益髓生血顆粒治療3個(gè)月后，8例α-地貧患者療后2、3月Hb水平與療前相比顯著升高(P＜0.05);療后2個(gè)月RBC水平顯著升高(P＜0.05)。8例β-地貧患者療后1至3個(gè)月，Hb水平有升高的趨勢(shì)，HbF水平顯著升高(P＜0.01或P＜0.05);療后2個(gè)月Ret水平顯著升高(P＜0.05); RBC水平無明顯差異。

16、r>　　2)經(jīng)益髓生血顆粒治療3個(gè)月后，16例地貧患者面色萎黃、潮熱盜汗、眩暈、心悸、咽干的中醫(yī)證候量化評(píng)分與療前相比顯著降低(P＜0.01或P＜0.05);腰膝酸軟的中醫(yī)癥候量化評(píng)分與療前相比有降低的趨勢(shì)。
　　3.2益髓生血顆粒治療地貧患者療效分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　1)治療前后珠蛋白鏈比結(jié)果顯示:8例α-地貧患者α-珠蛋白相對(duì)β-珠蛋白表達(dá)水平與療前相比顯著升高(P＜0.01);Aγ-、Gγ-珠蛋白表達(dá)水平相對(duì)β-珠蛋

17、白的表達(dá)與療前相比無顯著差異。8例β-地貧患者Aγ-珠蛋白相對(duì)α-珠蛋白的表達(dá)水平與療前相比有升高的趨勢(shì)，β-、Gγ-珠蛋白相對(duì)于α-珠蛋白的表達(dá)與療前相比無明顯差異。
　　2)治療前后DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)結(jié)果顯示:8例α-地貧患者DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA表達(dá)與療前相比顯著降低(P＜0.01); DNMT3a、DNMT1的蛋白表達(dá)水平與療前相比顯著隆低（P＜0.01)，DNMT3b的蛋白表達(dá)與療前相比有降低

18、的趨勢(shì)。
　　3)治療前后BCL11A表達(dá)水平研究結(jié)果顯示:8例β-地貧患者BCL11A基因表達(dá)與療前相比顯著降低(P＜0.05)。
　　4)治療前后紅細(xì)胞抗氧化損傷水平結(jié)果顯示:16例地貧患者GSH-Px、SOD活性與療前相比顯著升高(P＜0.01)，MDA含量與療前相比顯著降低(P＜0.01)。
　　5)治療前后紅細(xì)胞膜骨架蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示:16例地貧患者SPTA1、SPTB的mRNA表達(dá)水平與療前相比顯著升高

19、(P＜0.05或P＜0.01); EPB4.1 mRNA的表達(dá)水平與療前相比無明顯差異。
　　6)治療前后紅細(xì)胞膜相關(guān)酶活性結(jié)果顯示:與療前相比，地貧患者Na+-K+-ATP酶、T-ATP酶活性顯著升高(P＜0.05); Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性與療前相比無明顯差異。
　　7)治療前后造血細(xì)胞因子活性結(jié)果顯示:地貧患者SCF、GM-CSF的活性與療前相比顯著升高(P＜0.01)，IL-3的活性與療前相比顯著降低(P

20、＜0.01)。
　　從臨床療效觀察和紅細(xì)胞溶血貧血相關(guān)指標(biāo)測(cè)定，提示益髓生血顆粒治療地貧可能與促進(jìn)紅細(xì)胞生成，延長(zhǎng)紅細(xì)胞壽命，減少紅細(xì)胞溶血等方面發(fā)揮療效作用有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1、地貧患者證候季節(jié)變化的臨床觀察
　　通過組間比較和同一組地貧患者的連續(xù)觀察提示:地貧患者溶血貧血的臨床癥狀存在季節(jié)變化的客觀性，臨床癥狀的嚴(yán)重程度與主要血液指標(biāo)Hb水平的變化相一致，即氣溫高的季節(jié)比氣溫低的季節(jié)溶血貧血嚴(yán)重。

21、>　　2、地貧患者證候季節(jié)變化與溶血貧血相關(guān)指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)研究
　　1) SI、SF水平檢測(cè)結(jié)果提示:地貧患者夏季SI、SF水平高于冬季。提示地貧患者夏季溶血貧血重于冬季可能與夏季鐵超載較重有關(guān)。
　　2)氧化損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果提示:地貧患者冬季SOD、GSH-Px活性低于夏季，MDA的含量冬季顯著低于夏季。夏季MDA含量高于冬季，加重了紅細(xì)胞氧化損傷，激發(fā)了體內(nèi)代償機(jī)制使SOD、GSH-Px活性代償性升高，從一個(gè)側(cè)面提示地貧患者

22、夏季溶血貧血較重。
　　3)紅細(xì)胞包涵體含量檢測(cè)結(jié)果提示:地貧患者夏季紅細(xì)胞包涵體含量高于冬季。包涵體沉積在紅細(xì)胞膜上，受氧化和機(jī)械損傷作用導(dǎo)致溶血，這可能是地貧患者夏季溶血貧血較重的原因之一。
　　4)紅細(xì)胞膜骨架蛋白mRNA的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果提示:地貧患者證候季節(jié)變化與紅細(xì)胞膜骨架蛋白mRNA的表達(dá)水平的差異有關(guān)。
　　5)造血細(xì)胞因子活性檢測(cè)結(jié)果提示:地貧患者夏季貧血重于冬季可能與冬夏兩季造血細(xì)胞因子活性差異有關(guān)。<

23、br>　　6)紅細(xì)胞膜相關(guān)酶活性檢測(cè)結(jié)果提示:地貧患者夏季溶血重于冬季可能原因之一與冬夏兩季紅細(xì)胞膜離子通透酶活性差異有關(guān)。
　　3、基于紅細(xì)胞溶血貧血探討益髓生血顆粒治療地貧臨床療效的分子機(jī)制
　　3.1治療前后16例地貧患者（8例α-地貧和8例β-地貧）的臨床觀察
　　益髓生血顆粒能有效改善地貧患者的臨床癥狀，改善地貧患者主要血液指標(biāo)Hb水平，患者臨床癥狀改善程度與Hb相一致。進(jìn)一步驗(yàn)證了益髓生血顆粒治療地貧的肯定

24、療效。
　　3.2基于紅細(xì)胞溶血貧血探討益髓生血顆粒治療地貧患者的療效實(shí)驗(yàn)研究
　　1)珠蛋白鏈比檢測(cè)結(jié)果提示:益髓生血顆?？赡芡ㄟ^促進(jìn)地貧患者珠蛋白鏈比的平衡改善地貧患者紅細(xì)胞溶血貧血。
　　2) DNA甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA和蛋白水平檢測(cè)結(jié)果提示:益髓生血顆?？赡芡ㄟ^抑制DNMTs的活性，降低DNA甲基化對(duì)α-珠蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用，提高α-肽鏈的合成，促進(jìn)珠蛋白鏈比平衡，改善紅細(xì)胞溶血貧血。
　　3)

25、BCL11A mRNA水平檢測(cè)結(jié)果提示:益髓生血顆?？赡芡ㄟ^下調(diào)BCL11AmRNA的表達(dá)，促進(jìn)Aγ-珠蛋白mRNA表達(dá)，進(jìn)而提高機(jī)體HbF含量，來緩解患者的貧血癥狀。與療后主要血液指標(biāo)HbF水平升高相一致。
　　4)氧化損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示:益髓生血顆粒可能通過提高紅細(xì)胞抗氧化損傷酶活性，抑制自由基對(duì)紅細(xì)胞膜的過氧化損傷作用，維持紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，延長(zhǎng)紅細(xì)胞的壽命，減輕紅細(xì)胞溶血貧血。
　　5)紅細(xì)胞膜骨架蛋白檢測(cè)

26、結(jié)果提示:益髓生血顆粒能上調(diào)紅細(xì)胞膜骨架蛋白收縮蛋白的表達(dá)，維持紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，減輕紅細(xì)胞溶血貧血。
　　6)紅細(xì)胞酶活性檢測(cè)結(jié)果提示:益髓生血顆粒治療地貧的機(jī)制之一可能是通過減輕過氧化物質(zhì)對(duì)紅細(xì)胞膜的損傷作用來提高紅細(xì)胞膜酶活性，進(jìn)而更好的維持紅細(xì)胞膜變形性、完整性，減輕紅細(xì)胞溶血貧血。
　　7)造血細(xì)胞因子活性檢測(cè)結(jié)果提示:益髓生血顆?？赡芡ㄟ^提高SCF、GM-CSF的活性，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞和多種造血細(xì)胞的增殖和分化，提

27、高有效紅細(xì)胞生成來緩解地貧患者的臨床癥狀。
　　主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn):
　　1、以中醫(yī)“四時(shí)”理論對(duì)疾病的影響為切入點(diǎn)，首次探索季節(jié)變化對(duì)地貧患者臨床表現(xiàn)的影響，發(fā)現(xiàn)地貧患者夏季Hb水平低于冬季，夏季大多中醫(yī)證候量化評(píng)分水平高于冬季。提示，地貧患者夏季溶血貧血較重，冬季有所緩解，病情嚴(yán)重程度受季節(jié)變化的影響，并探討了這種變化的可能分子機(jī)制。研究結(jié)果為豐富中醫(yī)“四時(shí)”理論并為地貧臨床“適時(shí)治療”提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要的理論和實(shí)際意