2型糖尿病患者血清及糖負(fù)荷U-937細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:通過應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究糖尿病患者血清及高糖負(fù)荷U-937細(xì)胞的蛋白變化情況，探尋變化蛋白與糖尿病發(fā)展的相互作用機(jī)制，并探討VD應(yīng)用于糖尿病人群的分子作用機(jī)制，為糖尿病的人群防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:(1)人群實(shí)驗(yàn):隨機(jī)抽取青島市某綜合醫(yī)院2013年就診的10例2型糖尿病患者作為病例組，匹配選取該地同期正常健康人群10例作為對(duì)照組。兩組人群均采集清晨空腹血液，離心獲得上層血清進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，選取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)做質(zhì)譜(M

2、ALDI-TOF-MS)鑒定，并對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):采用人白血病單核細(xì)胞株U-937，將細(xì)胞分為3組，空白對(duì)照組采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基進(jìn)行正常培養(yǎng)，未進(jìn)行任何干預(yù);單純高糖組以D-葡萄糖終濃度為45 mmol/L的高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);VD3干預(yù)高糖組則以VD。含量為1.6×10-4mmol/L標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)2h后，再加入D-葡萄糖終濃度為45 mmol/L的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有分組均在37℃、5％CO2

3、條件下培養(yǎng)48小時(shí)后裂解細(xì)胞收集總蛋白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。不同批次的樣本在相同條件、不同時(shí)間下分別進(jìn)行SDS-PAGE雙向電泳，選取差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間的MALDI-TOF-MS鑒定，并對(duì)鑒定蛋白進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證。
　　結(jié)果:(1)人群實(shí)驗(yàn)中，病例組與對(duì)照組相比表達(dá)明顯差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)有6個(gè)，MALDI-TOF-MS成功鑒定出4種蛋白質(zhì)分別為:叢生蛋白前體蛋白、C反應(yīng)蛋白、抑制素、過氧化氫酶。(2)細(xì)胞

4、實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組與單純高糖組比較表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)有73個(gè)，維生素D干預(yù)高糖組與單純高糖組比較表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)有66個(gè)，進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)單純高糖組表達(dá)變化趨勢(shì)與另兩組一致的蛋白質(zhì)點(diǎn)有30個(gè)。選取其中13個(gè)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，成功鑒定出13種蛋白質(zhì)，分別為:抑制素、T-復(fù)合蛋白、甘露糖-6-磷酸受體結(jié)合蛋白1、過氧化氫酶、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、嘌呤核苷磷酸化酶、微管解聚蛋白、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白、延胡索先乙酰乙酸水解酶、70KD的熱休克蛋白質(zhì)8、肌

5、動(dòng)蛋白、磷酸丙糖異構(gòu)酶、線粒體ATP合酶亞基D。
　　結(jié)論:本研究應(yīng)用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)鑒定出了糖尿病患者血清表達(dá)變化的蛋白質(zhì)和VD對(duì)糖負(fù)荷U-937細(xì)胞產(chǎn)生作用的相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，這些差異表達(dá)蛋白主要與細(xì)胞氧化應(yīng)激和能量代謝有關(guān)，證明糖尿病患者體內(nèi)的高糖環(huán)境與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，考慮VD可能通過降低氧化應(yīng)激損傷和影響能量代謝的途徑調(diào)節(jié)高糖負(fù)荷產(chǎn)生的損傷;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與人群實(shí)驗(yàn)中，抑制素變化一致且有意義，因此可能是維生素D預(yù)防和治療