hTSHR體外轉(zhuǎn)染失分化型甲狀腺癌細胞株后再分化相關(guān)機制的實驗研究.pdf

1、本文對hTSHR體外轉(zhuǎn)染失分化型甲狀腺癌細胞株后再分化的相關(guān)機制進行了實驗研究。本研究分為兩個部分：
　　 目的：通過重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/hTSHR 體外瞬時轉(zhuǎn)染失分化型濾泡狀甲狀腺癌細胞株（FTC-133 亞型，sFTC-133）后，觀察轉(zhuǎn)染人的促甲狀腺激素受體（human thyrotropin receptor，hTSHR）的細胞攝碘能力及分化相關(guān)基因mRNA的變化水平，以明確TSHR 對失分化型甲狀腺癌細胞

2、株再分化的作用和意義。
　　 方法：重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/hTSHR 轉(zhuǎn)化DH5а 感受態(tài)菌，進行擴增，酶切，及核苷酸測序方法鑒定。體外轉(zhuǎn)染重組pcDNA3.1/hTSHR 質(zhì)粒，通過免疫熒光檢測TSHR 的表達產(chǎn)物， 125I 攝碘實驗檢測攝碘能力，相對定量實時熒光聚合酶鏈反應（Realtime-PCR）來檢測TSHR、鈉碘轉(zhuǎn)運體（NIS）、甲狀腺過氧化物酶（TPO）、甲狀腺球蛋白(Tg) mRNA 相對含量。統(tǒng)計

3、學檢驗方法采用SPSS 13.0軟件，計量資料采用t 檢驗，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：pcDNA3.1/hTSHR 經(jīng)PCR 擴增 hTSHR-cDNA 片段約113kb，Kpn I 和XbaI 雙酶切后：hTSHR-cDNA 的片段約2.3 kb，pcDNA3.1(+)的片段約5.5 kb，均同預期片段大小相符；核苷酸測序方法鑒定測序結(jié)果與GenBank 中收錄的hTSHR全長序列一致，表明真核表達質(zhì)粒

4、構(gòu)建正確。在hTSHR 刺激下，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/hTSHR 的細胞與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的細胞比較：①免疫熒光檢測在甲狀腺腫瘤細胞胞漿、胞膜有增強的綠色熒光，②125I 攝取率是對照組的2.9 倍（t=28.63，P<0.01），③甲狀腺碘攝取相關(guān)基因TSHR、NIS、TPO、Tg mRNA的表達分別升高1.7 倍(t=13.8, p<0.05)，4 倍(t=28.52, p<0.05)，1.5 倍(t=14.43,p<0.

5、05)，2.2 倍(t=19.83，p<0.05)。
　　 結(jié)論：重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/hTSHR 體外轉(zhuǎn)染甲狀腺癌腫瘤細胞后，可有效提高碘的攝取及分化相關(guān)基因的表達，為失分化甲狀腺癌放射性碘治療提供了一個新的依據(jù)。
　　 第二部分：
　　 目的：構(gòu)建hTSHR 基因的的重組慢病毒表達載體，并感染失分化型濾泡狀甲狀腺癌細胞株（FTC-133 亞型，sFTC-133），觀察hTSHR 的表達，并構(gòu)建穩(wěn)定

6、表達hTSHR 的sFTC-133 細胞。
　　 方法：運用巢式PCR 技術(shù)對重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/hTSHR 中突變位點C進行誘變回正常的序列G，經(jīng)PCR 擴增反應獲得hTSHR 基因，并將其連接到含有增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的慢病毒表達載pGC-FU 中，重組獲得慢病毒質(zhì)粒pGC-FU-hTSHR，經(jīng)PCR 擴增反應和DNA 測序方法鑒定重組體，鑒定正確的重組體將其與輔助包裝質(zhì)粒（pHelper 1.0

7、 載體，pHelper 2.0 載體）一起共轉(zhuǎn)染293T 細胞，包裝生產(chǎn)病毒并測定病毒滴度。所獲慢病毒感染失分化型甲狀腺癌細胞株后，采用熒光顯微鏡的方法檢測hTSHR 的表達。
　　 結(jié)果：PCR擴增實驗證實hTSHR 基因已定向連入慢病毒表達載pGC-FU 目的載體，DNA 測序結(jié)果顯示，所構(gòu)建的pGC-FU-hTSHR 重組慢病毒質(zhì)粒序列與目標序列完全一致, 表明重組質(zhì)粒pGC-FU-hTSHR 已構(gòu)建成功，且獲得的病毒滴度