弓形蟲GRA7基因的克隆與表達.pdf

1、研究背景與目的該研究首先分析弓形蟲不同分離株GRA7基因的異同;構(gòu)建pGEX-4T-1/GRA7重組質(zhì)粒大腸桿菌表達體系,實現(xiàn)目的蛋白的體外表達,并對目的蛋白的抗原性進行分析;用純化的重組融合蛋白作為包被抗原,做ELISA,檢測陰性、陽性血清,以期對其血清學診斷價值作出客觀的評價,為新型弓形蟲病診斷試劑盒的研制奠定基礎(chǔ).研究方法1.弓形蟲不同分離株GRA7基因的保守性鑒定從弓形蟲感染的小鼠腹水中提取不同分離株(RH株、ZS<,2>株和G

2、T株)的基因組DNA,然后以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物電泳鑒定.利用三種限制性內(nèi)切酶(Esp3I、CfrI和MboI)對目的基因進行酶切,并分析酶切產(chǎn)物.再將目的基因重組入載體pGEX-4T-1,送基因公司測序,序列對比分析.2.pGEX-4T-1/GRA7重組質(zhì)粒的構(gòu)建及GST融合蛋白的表達將質(zhì)粒DNA和GRA7基因分別進行雙酶切(BamHI、EcoRI),純化、鑒定并連接酶切產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌,構(gòu)建pGEX-

3、4T-1/GRA7重組質(zhì)粒.酶切、PCR鑒定,并送基因公司測序.優(yōu)化蛋白表達條件,IPTG體外誘導表達,對表達的融合蛋白進行SDS-PAGE和Western-blot分析.3.融合蛋白的純化和應(yīng)用利用GSTrap FF柱純化融合蛋白,用純化的融合蛋白作為包被抗原,做ELISA,檢測陰性、陽性血清.研究結(jié)論1.弓形蟲不同分離株(RH株、ZS<,2>株和GT株)GRA7基因具有高度保守性.2.構(gòu)建了pGEX-4T-1/GRA7重組質(zhì)粒,成功