水牛體外受精胚胎性別鑒定研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)依靠其靈敏、快速和操作簡單等優(yōu)點逐漸成為早期胚胎性別鑒定的主流技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)可以充分發(fā)揮公母畜各自的生產(chǎn)優(yōu)勢，提高育種效率。我國南方各省的水牛乳業(yè)資源豐富，發(fā)展?jié)摿薮?，開展水牛早期胚胎性別鑒定研究工作的意義重大。但在性別鑒定的具體操作過程中，還存在著由于單一擴(kuò)增雄性特有的性別決定基因(Sry)失敗判定為陰性，雙引物雙重PCR擴(kuò)增時由于Sry基因單拷貝而常染色體基因多重復(fù)導(dǎo)致Sry

2、基因擴(kuò)增不充分或未能擴(kuò)增等問題。本研究采用雙引物兩步PCR對水牛血液白細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定，彌補單對引物擴(kuò)增時出現(xiàn)假陰性、雙引物雙重PCR擴(kuò)增時Sry基因不易擴(kuò)增的不足，進(jìn)一步提高性別鑒定的精確度，優(yōu)化性別鑒定體系。應(yīng)用該優(yōu)化的性別鑒定體系對水牛早期16細(xì)胞胚胎性別鑒定的最適胚胎模板量進(jìn)行了探討，并對胚胎培養(yǎng)液中添加不同血清對水牛早期胚胎不同發(fā)育階段性別比率的影響進(jìn)行了初步研究。試驗結(jié)果如下： 1.雙引物兩步PCR鑒定水牛血液白細(xì)胞

3、性別研究：對引物設(shè)計的合理性和雙引物兩步PCR對性別鑒定的效果進(jìn)行探討，以期解決單對Sry基因引物擴(kuò)增時易出現(xiàn)假陰性、雙引物雙重PCR擴(kuò)增時Sry基因不易擴(kuò)增的問題，優(yōu)化性別鑒定體系。 (1)引物設(shè)計及其合理性檢測：根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫中公布的公水牛特有的Y染色體性別決定基因(Sry)序列和公、母水牛共有的常染色體1.715衛(wèi)星DNA序列，應(yīng)用Primer5.0引物設(shè)計軟件自主設(shè)計了兩對引物S1/S2、B1/B2。S1/S2引

4、物用于Sry基因體外擴(kuò)增，B1/B2引物用于1.715衛(wèi)星DNA序列體外擴(kuò)增。應(yīng)用所設(shè)計的兩對引物分別對公母水牛血液白細(xì)胞基因組進(jìn)行體外擴(kuò)增，結(jié)果顯示，第一對引物S1/S2能夠有效的對公水牛血液白細(xì)胞基因組Sry基因進(jìn)行擴(kuò)增，而對母水牛血液白細(xì)胞基因組則無相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物長度為350bp，與所設(shè)計引物的理論擴(kuò)增值相符。第二對引物B1/B2在對公母水牛血液白細(xì)胞基因組1.715衛(wèi)星DNA序列進(jìn)行體外擴(kuò)增時，均有長度為149bp擴(kuò)增

5、產(chǎn)物出現(xiàn)，也與所設(shè)計引物的理論擴(kuò)增值相符。 試驗結(jié)果表明：所設(shè)計的兩對引物能夠有效的對公水牛特有的Sry基因和公母水牛共有的1.715衛(wèi)星DNA序列進(jìn)行體外擴(kuò)增，可應(yīng)用于性別鑒定體系。 (2)雙引物雙重PCR鑒定水牛血液白細(xì)胞性別研究：為了杜絕單一Sry基因擴(kuò)增失敗或胚胎丟失導(dǎo)致的假陰性現(xiàn)象，本試驗應(yīng)用雙引物雙重PCR對公水牛血液白細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定。同時擴(kuò)增出兩條特異擴(kuò)增帶的判定為雄性。結(jié)果顯示，全部10份血樣均成功擴(kuò)增

6、出1.715衛(wèi)星DNA序列(149bp)，但只有3份血樣擴(kuò)增出Sry基因(350bp)，準(zhǔn)確率為30.00﹪(3/10)。 試驗結(jié)果表明：雙引物雙重PCR雖然可以避免單一Sry基因擴(kuò)增失敗或胚胎丟失導(dǎo)致的假陰性現(xiàn)象，提高性別鑒定的準(zhǔn)確性，但由于Sry基因為單拷貝，而1.715衛(wèi)星DNA序列為多重復(fù)序列，在進(jìn)行同步擴(kuò)增時，由于后者的模板量大，反應(yīng)的競爭力強，因此會導(dǎo)致Sry基因擴(kuò)增不充分或完全擴(kuò)增不出特異擴(kuò)增帶。 (3)雙

7、引物兩步PCR鑒定水牛血液白細(xì)胞性別研究：針對雙引物雙重PCR進(jìn)行性別鑒定時單拷貝Sry基因在反應(yīng)中的競爭力差的問題，本試驗首先采用雙引物兩步PCR進(jìn)行公水牛血液白細(xì)胞性別鑒定。先加入第一對引物對單拷貝的SRY基因進(jìn)行11個循環(huán)擴(kuò)增，使得隨后的雙重擴(kuò)增時兩種基因序列的模板量趨于一致，再加入第二對引物進(jìn)行雙重同步擴(kuò)增。結(jié)果顯示，5份公牛血樣均成功擴(kuò)增出的兩條特異擴(kuò)增帶(350bp，149bp)。性別鑒定準(zhǔn)確率為100﹪(5/5)。隨后分別

8、對兩份公牛血樣和兩份母牛血樣進(jìn)行性別鑒定，結(jié)果顯示，2份公水牛血樣均可擴(kuò)增出兩條特異擴(kuò)增帶(350bp，149bp)，而兩份母水牛血樣只擴(kuò)增出一條擴(kuò)增帶(149bp)。性別鑒定準(zhǔn)確率為100﹪(4/4)。 試驗結(jié)果表明：兩步PCR能夠成功對水牛血液白細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定，準(zhǔn)確率為100﹪。并能夠克服單對Sry基因引物擴(kuò)增時易出現(xiàn)假陰性、雙引物雙重PCR擴(kuò)增時Sry基因不易擴(kuò)增的缺點。以下試驗中均采用兩步PCR進(jìn)行水牛早期胚胎性別鑒定

9、。 2.水牛早期胚胎性別鑒定最適胚胎模板量研究：應(yīng)用前面試驗優(yōu)化的性別鑒定體系分別以4個和2個胚胎卵裂球為模板對水牛16細(xì)胞胚胎進(jìn)行了性別鑒定。結(jié)果顯示，以4個卵裂球作為模板時，23枚體外受精胚胎性別鑒定中雄性胚胎較多(13/23，56.52﹪)，雄性和雌性胚胎的比率接近1∶1。以2個卵裂球作為模板時，雌雄胚胎比例偏離1∶1的比值較遠(yuǎn)，雌性胚胎明顯偏多(19/26，73.08﹪)。 試驗結(jié)果表明：對水牛早期體外受精胚胎進(jìn)

10、行性別鑒定時，應(yīng)使用至少4個卵裂球作為PCR反應(yīng)的模板，以保證性別鑒定的準(zhǔn)確率。利用水牛血液基因組建立的性別鑒定體系能夠成功的對水牛體外受精胚胎進(jìn)行性別鑒定。 3.胚胎培養(yǎng)液中添加不同血清對水牛早期胚胎不同發(fā)育階段性別比率的影響：本試驗應(yīng)用本實驗室建立的水牛早期體外受精胚胎性別鑒定體系，比較了在胚胎培養(yǎng)液中添加胎牛血清(FCS)、發(fā)情牛血清(OCS)和不添加血清對水牛體外受精胚胎發(fā)育能力及同一時間處于不同發(fā)育階段胚胎的性別比率的

11、影響。 試驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)至第四天收集到的各組胚胎中，不添加血清組胚胎只能發(fā)育到8細(xì)胞期，而添加發(fā)情牛血清和胎牛血清的處理組胚胎均可發(fā)育到16細(xì)胞期，且添加胎牛血清組的胚胎發(fā)育潛力優(yōu)于發(fā)情牛血清組。但兩組之間的16細(xì)胞期胚胎發(fā)育率(18/62，29.03﹪Vs13/59,22.03﹪)差異不顯著(P＞0.05)。各血清組中處于同一時間不同發(fā)育階段的胚胎性別比例的差異不顯著(P＞0.05)，雄性胚胎比率均接近50﹪。胎牛血清組從4

12、細(xì)胞期到8細(xì)胞期的發(fā)育過程中雄性胚胎比率有逐漸上升的趨勢。而不添加血清組和添加發(fā)情牛血清組的不同階段雄性胚胎率未表現(xiàn)出隨著胚胎的不斷發(fā)育，雄性胚胎比率逐漸增多的現(xiàn)象。 試驗結(jié)果表明：添加發(fā)情牛血清可以在一定程度上促進(jìn)胚胎的生長發(fā)育，穩(wěn)定胚胎的性別比率。可用發(fā)情牛血清代替胎牛血清用于胚胎體外生產(chǎn)。 綜上所述：本研究中所設(shè)計的兩對引物特異性較強，采用雙引物兩步PCR對水牛血液白細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定，彌補單對引物擴(kuò)增時出現(xiàn)假陰性、

13、雙引物雙重PCR擴(kuò)增時Sry基因不易擴(kuò)增的不足，進(jìn)一步提高性別鑒定的精確度，優(yōu)化性別鑒定體系。利用優(yōu)化了的性別鑒定體系能夠成功對水牛早期體外受精胚胎進(jìn)行性別鑒定。在性別鑒定過程中應(yīng)以至少4個卵裂球作為PCR反應(yīng)模板。應(yīng)用建立的性別鑒定體系對同一時間位于不同發(fā)育階段(阻滯期前后的4細(xì)胞、8細(xì)胞、16細(xì)胞)水牛ⅣF早期胚胎進(jìn)行性別鑒定發(fā)現(xiàn)添加發(fā)情牛血清可以在一定程度上促進(jìn)胚胎的生長發(fā)育，并且穩(wěn)定胚胎的性別比率，從而進(jìn)一步減少影響體外生產(chǎn)胚胎