卵巢癌鉑類耐藥標記蛋白Annexin A3對臨床化療耐藥預測作用的前瞻性研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 卵巢上皮癌是女性生殖器官中死亡率居第一位的惡性腫瘤，目前的標準治療方案是在腫瘤細胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔以紫杉醇和鉑類聯(lián)合的一線化療，但是預后不理想，晚期患者的5年生存率仍然徘徊在30％左右。腫瘤細胞對于化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成卵巢癌的5年生存率得不到進一步改善的主要原因之一，初治患者的完全緩解率接近75％，仍有15-30％的患者對初治方案反應不佳;在達到完全緩解的患者中，有＞90％的患者腫瘤復發(fā)。如何早期發(fā)現(xiàn)

2、和診斷化療耐藥，進一步改善卵巢癌的預后是當前困擾婦科腫瘤臨床的主要問題之一。卵巢癌患者對鉑類藥物耐藥的臨床評價標準要到化療進行到一定階段，或腫瘤復發(fā)后，才能判斷出患者對于化療藥物的敏感性，因此發(fā)現(xiàn)一種鉑類耐藥標記蛋白在患者接受化療之前或治療初期預知腫瘤的耐藥性，及時調(diào)整化療方案是解決這一問題的關(guān)鍵途徑。
　　 本課題組前期運用比較蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選出了鉑類耐藥相關(guān)蛋白—膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3，ANXA3)，并在體外細

3、胞實驗、動物實驗及臨床研究中逐步驗證了該指標和鉑耐藥的相關(guān)性、影響鉑耐藥的機制、血清可檢測性以及在臨床中作為鉑耐藥預測指標的可行性。因為市售Annexin A3 ELISA試劑盒敏感性欠佳、重復性差，本課題組研制了具有較高靈敏性、可重復性的Annexin A3化學發(fā)光定量檢測試劑盒，并在小樣本的前瞻性臨床研究中觀察了該方法檢測的治療前Annexin A3血清濃度對鉑類化療耐藥的診斷價值，發(fā)現(xiàn)該指標具有中等預測價值，ROC曲線下面積為0.

4、744，最佳界值點為1.645，該界值的預測敏感度及特異度分別為66.70％、82.93％，陽性及陰性預測值分別為58.82％、87.18％。
　　 本研究在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上前瞻性連續(xù)收集臨床初治的卵巢癌患者的血清學和組織學標本，以化學發(fā)光免疫分析和免疫組化技術(shù)分別檢測AnnexinA3蛋白在觀察對象外周血和腫瘤組織中的表達水平，評估Annexin A3蛋白在患者外周血和腫瘤組織中的表達水平對臨床化療耐藥的預測作用及多指標聯(lián)合檢

5、測提高預測價值的可行性，并對Annexin A3蛋白血清表達在復發(fā)上皮性卵巢癌患者中的臨床意義進行了初步探討。
　　 研究方法：
　　 1、進一步擴大樣本量，在較大樣本患者中分析Annexin A3的血清濃度和鉑類化療耐藥的關(guān)系;通過繪制ROC曲線評價其診斷價值，確定最佳界值點;并將擴大樣本前后Annexin A3的血清濃度對鉑類耐藥的診斷價值進行比較。觀察Annexin A3血清濃度對初治患者無進展生存的影響。

6、　　 連續(xù)性收集初治上皮性卵巢癌患者治療前血清標本及病例資料;采用AnnexinA3化學發(fā)光定量檢測試劑盒測定收集標本的Annexin A3蛋白血清濃度并對其分布進行分析;通過查病例或電話回訪隨訪患者的鉑化療結(jié)局;對Annexin A3蛋白血清濃度和臨床病理特征進行Spearman相關(guān)性分析;觀察鉑類敏感及耐藥組間AnnexinA3血清濃度的表達差別并通過Logistic多因素模型分析AnnexinA3蛋白血清濃度和鉑耐藥的相關(guān)性;繪

7、制ROC曲線評價AnnexinA3蛋白血清濃度預測鉑類耐藥的價值，確定最佳界值點，觀察該界值點的敏感度、特異度、陽性預測值及陰性預測值，并對擴大樣本前后Annexin A3蛋白血清濃度對鉑類耐藥的預測價值進行比較;在Cox多因素模型中分析Annexin A3血清水平對PFS的影響，并通過Log rank檢驗比較以最佳界值確定的Annexin A3高濃度組及低濃度組間PFS生存曲線的差別。
　　 2、通過免疫組化技術(shù)檢測Annex

8、in A3蛋白在同一研究人群中的組織表達;分析Annexin A3蛋白的組織表達和鉑類耐藥的相關(guān)性;通過制作ROC曲線評價AnnexinA3蛋白對鉑類耐藥的預測價值;觀察Annexin A3組織表達對PFS的影響;在同一研究人群中將Annexin A3蛋白的組織表達和血清濃度對鉑類耐藥的預測價值進行比較。
　　 采用免疫組化方法對同一研究人群中腫瘤組織的AnnexinA3蛋白表達進行半定量檢測;將“陰性”及“+”表達患者定義為低

9、表達組，將“++”及“+++”表達患者定義為高表達組，觀察鉑類敏感及耐藥人群中Annexin A3蛋白的組織表達差異并通過多因素分析觀察Annexin A3組織表達與鉑化療耐藥的相關(guān)性;繪制ROC曲線計算曲線下面積評價Annexin A3組織表達對鉑耐藥的診斷價值，確定最佳界值點，觀察該界值點的敏感性、特異性、陽性預測值及陰性預測值，并比較Annexin A3組織表達和血清濃度診斷鉑耐藥ROC曲線下面積的大小;通過多因素生存分析觀察An

10、nexinA3組織表達對患者預后的影響并比較Annexin A3蛋白高表達組及低表達間PFS生存的差別。
　　 3、通過體外細胞實驗觀察Cofilin-1蛋白作為鉑耐藥血清聯(lián)合預測指標的可行性。穩(wěn)定培養(yǎng)SKOV3、SKOV3/CDDP、COC1及COC1/CDDP細胞系;檢測SKOV3/CDDP及COC1/CDDP兩株耐藥細胞系的耐藥指數(shù);通過Western Blot及免疫熒光實驗比較Cofilin-1蛋白在耐藥及敏感細胞株中的

11、表達差異并對蛋白進行定位研究;濃縮細胞上清并通過Western Blot觀察Cofilin-1是否在細胞上清中表達。
　　 SKOV3及耐藥株SKOV3/CDDP用DMEM(HG)培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，COC1及其耐藥株COC1/CDDP用RPMI1640培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。運用MTT法檢測SKOV3及SKOV3/CDDP細胞株的IC50，計算SKOV3/CDDP對SKOV3的耐藥指數(shù);運用CCK-8法檢測COC1及COC1/CDDP細胞

12、系的IC50，計算COC1/CDDP對COC1的耐藥指數(shù)。待細胞處于對數(shù)生長期時，收集細胞裂解后BCA法測定蛋白濃度，運用Western Blot法對細胞的Cofilin-1蛋白表達水平進行半定量檢測;通過免疫熒光法觀察Cofilin-1蛋白在爬片細胞中的定位并比較敏感及耐藥細胞中的熒光表達差別;用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，收集細胞培養(yǎng)上清后用超濾管離心濃縮蛋白，Western Blot法檢測上清液中Cofilin-1蛋白的表達。
　

13、　 4、回顧性分析第二部分研究對象中未先期化療患者術(shù)后首次化療前后的CA125下降比率與鉑類耐藥的相關(guān)性;通過建立ROC曲線評估CA125下降比率及其和Annexin A3血清濃度聯(lián)合對鉑類耐藥的預測價值;將聯(lián)合檢測及其單因子檢測對鉑類耐藥的預測價值進行比較。
　　 回顧性收集第二部分研究對象中未先期化療患者術(shù)后首次化療前后的CA125值，計算CA125下降比率并觀察其分布情況;比較敏感及耐藥人群中的CA125下降比率并對CA

14、125下降比率和鉑耐藥之間的相關(guān)性進行Logistic多因素回歸分析;制作CA125下降比率預測鉑類耐藥的ROC曲線，觀察曲線下面積，并通過建立CA125下降比率和Annexin A3血清濃度預測鉑類耐藥的Logistic多因素回歸模型，繪制兩者聯(lián)合檢測的ROC曲線;將聯(lián)合檢測及單因子檢測的曲線下面積進行比較。
　　 5、用化學發(fā)光定量檢測試劑盒檢測復發(fā)上皮性卵巢癌患者治療前血清的AnnexinA3蛋白水平;并對治療前Annex

15、in A3蛋白血清濃度和鉑化療結(jié)局的關(guān)系進行初步探討。
　　 連續(xù)收集復發(fā)上皮性卵巢癌患者治療前的血清標本，隨訪患者治療結(jié)局;采用化學發(fā)光定量檢測試劑盒測定復發(fā)患者的Annexin A3蛋白血清濃度并觀察其分布情況;將患者按無鉑間期長短分成兩組（＜12月VS≥12月），觀察每組患者治療前Annexin A3蛋白的血清表達水平并進行組間比較;將有化療結(jié)局的患者按鉑化療敏感及鉑化療耐藥分組，觀察Annexin A3蛋白血清水平的組間

16、差異;觀察化療結(jié)束后不同時間點疾病進展和Annexin A3蛋白血清濃度的相關(guān)性;將患者按50百分位數(shù)分成Annexin A3蛋白高濃度組及低濃度組，比較兩組間PFS生存的差別。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、自2009年9月至2012年4月期間在北京協(xié)和醫(yī)院就診的初治上皮性卵巢癌患者96例，采用化學發(fā)光試劑盒定量檢測治療前血清的Annexin A3蛋白水平，批內(nèi)差異＜15％，批間差異＜20％。89例患者有鉑類化療結(jié)局，直

17、方圖及P-P圖顯示其Annexin A3血清濃度呈非正態(tài)分布，Kolmogorov-Smirnov Z檢驗Z值為1.475，P值為0.026;89例患者的濃度范圍0.20 ng/mL～6.18 ng/mL，中位濃度為1.20 ng/mL，四分位間距為1.62 ng/mL。截止2013年3月，3例(3.13％)失訪，患者中位隨訪時間為14月（7月-39月）;鉑類化療敏感患者68例，鉑類化療耐藥（包括難治）患者21例。68例鉑敏感患者治療前

18、外周血Annexin A3蛋白濃度為1.33±0.91 ng/mL，顯著高于鉑耐藥患者的2.28±1.69 ng/mL(P=0.001);Logistic多因素分析顯示Annexin A3血清濃度及手術(shù)徹底性與鉑類化療耐藥/難治有顯著相關(guān)性，P值分別為0.028及0.016。治療前Annexin A3血清水平預測鉑類耐藥的ROC曲線曲線下面積為0.733，最佳界值為2.05 ng/mL時，該界值的敏感度為61.11％，特異度為80.88

19、％，陽性預測值為45.8％，陰性預測值為88.7％;擴大樣本后的ROC曲線下面積較預實驗略增加。Annexin A3血清高表達組(≥2.05ng/mL)的中位PFS時間較低濃度組＜2.05 ng/mL)長（14月vs11.5月），COX多因素分析顯示Annexin A3血清濃度(P=0.002)和手術(shù)徹底性(P=0.001)對PFS有顯著影響，log-rank檢驗顯示AnnexinA3血清高濃度組及低濃度組的PFS生存差異顯著(P＜0.

20、05)。
　　 2、89例初治上皮性卵巢癌患者中38(42.7％)例Annexin A3陰性表達，30(33.7％)例表達為“+”，15(16.9％)例表達為“++”，6(6.7％)例表達為“+++”;68例(75.3％)患者低表達，21(24.7％)例患者高表達。Spearman相關(guān)性分析顯示Annexin A3組織表達和和鉑耐藥相關(guān)性顯著(P=0.012)，相關(guān)系數(shù)為0.266。鉑耐藥患者中高表達患者占42.9％,顯著高于鉑

21、敏感人群的17.6％(P=0.017)。多因素分析顯示Annexin A3組織表達（低表達&高表達，P=0.004）及手術(shù)徹底性(P=0.002)和鉑耐藥顯著相關(guān)。Annexin A3組織表達預測鉑類耐藥的ROC曲線下面積為0.664，當Annexin A3組織表達≥++時，約登指數(shù)最大，此界值的敏感度及特異度分別為42.86％及82.35％，陽性預測值及陰性預測值分別為58.82％及87.18％。Annexin A3組織表達預測鉑耐藥

22、的ROC曲線下面積小于Annexin A3血清濃度的ROC曲線下面積，但差異無顯著性(0.664&0.773，P=0.544)。多因素生存分析顯示Annexin A3組織表達及手術(shù)徹底性對PFS影響顯著（P值分別為0.010及0.004），Annexin A3低表達組的PFS時間較高表達組長（14月vs11月），Log-rank檢驗顯示Annexin A3高表達及低表達組間PFS生存有顯著差異(P＜0.001)。
　　 3、SK

23、OV3、SKOV3/CDDP、COC1及COC1/CDDP細胞生長狀態(tài)良好， SKOV3/CDDP對SKOV3的耐藥指數(shù)平均為6.40±1.55，COC1/CDDP對COC1的耐藥指數(shù)平均為2.87±1.16。Western blot半定量檢測顯示Cofilin1蛋白在SKOV3/CDDP耐藥細胞胞漿中的表達高于SKOV3敏感細胞株，在COC1/CDDP胞漿中的表達高于COC1細胞株，其中以SKOV3耐藥及敏感株中的Cofilin1蛋白

24、差異更為明顯。細胞免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)Cofilin1蛋白定位于細胞胞漿，兩種細胞系中耐藥株的熒光強度均較敏感株強。細胞培養(yǎng)上清濃縮后westem blot未檢測到Cofilin1蛋白的表達。
　　 4、第二部分研究對象中首次化療前后CA125資料完整的未先期化療卵巢癌患者61例，其中鉑敏感患者48例，鉑耐藥患者13例。61例患者CA125下降率其總體分布呈非正態(tài)分布，Kolmogorov-Smirnov Z檢驗Z值為2.892，P

25、＜0.001。鉑耐藥患者的CA125下降比率中位數(shù)0.25顯著低于鉑敏感組的0.64(P=0.001)。去除1例極值，多因素分析顯示CA125下降比率及治療前Annexin A3血清濃度為鉑耐藥的顯著相關(guān)因素（P值分別為0.026及0.028）。CA125下降比率診斷鉑耐藥的ROC曲線下面積為0.813，最佳界值點為0.577，此點的敏感度及特異度為92.31％及61.70％，陽性及陰性預測值分別為40.0％，為96.7％。設鉑耐藥發(fā)生

26、風險值Y，建立AnnexinA3血清濃度及CA125下降率預測鉑耐藥的Logistic回歸模型LogY=-1.83+0.938×Annexin A3血清濃度-2.674×CA125變化率，Y值診斷鉑耐藥的ROC曲線下面積為0.863，最佳界值點的敏感度及特異度分別為92.31％及74.47％，陽性及陰性預測值分別為50.0％及97.2％。該聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積大于Annexin A3血清濃度單因子預測的曲線下面積(0.863&0.

27、745)，P值為0.053。
　　 5、納入符合標準的的復發(fā)性上皮性卵巢癌患者61例，其中54例無鉑間期≥6月，7例無鉑間期＜6月。鉑化療難治性患者9例，鉑類化療耐藥患者8例，鉑類化療敏感患者7例。化學發(fā)光法檢測治療前Annexin A3蛋白血清濃度板內(nèi)變異系數(shù)小于15％，板間變異系數(shù)小于20％。直方圖及P-P圖提示Annexin A3蛋白血清濃度呈正態(tài)分布(Z=265，P=.082)，平均濃度為0.77±0.56 ng/mL。

28、Spearman相關(guān)性分析顯示治療前Annexin A3血清濃度和鉑類化療耐藥無顯著相關(guān)性，P值為0.517。無鉑間期＜12月及≥12月的患者平均濃度為0.92±0.60 ng/ml及0.67±0.50ng/ml，差異無顯著性(P=0.08)。17例例鉑耐藥患者的中位Annexin A3血清濃度高于7例鉑敏感患者（0.87ng/mL vs0.67ng/mL），但組間差異無顯著性(P=0.314)?；熃Y(jié)束各時間點疾病進展患者的血清濃度高

29、于疾病無進展患者血清濃度，差別無顯著性。Annexin A3蛋白高濃度組的中位PFS時間較低濃度組短（6月vs7月），PFS生存比較無顯著差異(P=0.09)。
　　 結(jié)論：
　　 1、初治上皮性卵巢癌患者的外周血Annexin A3蛋白表達水平和鉑耐藥相關(guān)性顯著，對臨床鉑類耐藥有中等預測價值，最佳界值為2.05ng/mL。Annexin A3血清濃度及手術(shù)徹底性對鉑類耐藥及無進展生存均有顯著的影響。
　　 2、

30、初治上皮性卵巢癌患者腫瘤組織的Annexin A3蛋白表達和鉑耐藥顯著相關(guān)，對鉑耐藥預測價值低;Annexin A3蛋白組織表達預測鉑類耐藥的ROC曲線下面積小于Annexin A3血清濃度，但差異無顯著性;Annexin A3蛋白組織表達是無進展生存的顯著影響因素。
　　 3、體外細胞實驗證實Cofilin-1蛋白和鉑類耐藥相關(guān)，但是不具有細胞外泌性，因此不能作為鉑類耐藥預測的血清聯(lián)合檢測指標。
　　 4、CA125下