鴨瘟病毒感染及其誘導(dǎo)α干擾素mRNA水平的動態(tài)定量研究.pdf

1、鴨瘟病毒(DPV)為一種α皰疹病毒，是鴨瘟(DP)的病原。鴨瘟是鴨、鵝和天鵝等水禽的急性、高度接觸性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。進(jìn)行快速病毒檢測和了解其感染、傳播及致病機(jī)理是預(yù)防和控制本病的關(guān)鍵。傳統(tǒng)檢測DPV的方法存在著特異性及敏感性不高、費(fèi)時費(fèi)力等不足，不適于快速診斷、大規(guī)模檢疫及流行病學(xué)調(diào)查，因此，迫切需要一種快速、敏感的DPV檢測技術(shù)。雖然，傳統(tǒng)PCR已用于檢測DPV，但傳統(tǒng)定性PCR無法對病毒核酸進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。

2、 Real-time PCR技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種準(zhǔn)確定量DNA及mRNA表達(dá)水平的新技術(shù)，在病毒的快速檢測、致病機(jī)制及病毒與宿主相互作用等研究上十分有用。本研究基于real-time PCR技術(shù)，針對DPV感染分別進(jìn)行了以下幾方面的研究： 1．鴨瘟病毒real-time PCR方法的建立根據(jù)鴨瘟病毒DNA聚合酶基因的序列設(shè)計引物和探針，建立了基于TaqMan探針及SYBR Green Ⅰ染料技術(shù)的兩種real-t

3、ime PCR方法。結(jié)果表明，兩種方法均有很好的特異性、敏感性和可重復(fù)性，能準(zhǔn)確定量DPVDNA，其中，TaqMan技術(shù)最低可檢測23個拷貝的病毒DNA，在2.3×10<,1>～2.3×10<'5>copies的范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系(r=0.999)；而SYBR Green Ⅰ方法最低可檢測230個拷貝的病毒DNA，在23×10<'1>～23×10<'5>copies的范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系(r=0.995)；與傳統(tǒng)PCR方法相比，T

4、aqMan與SYBR Green I技術(shù)對病毒DNA檢測的敏感性分別高10<'4>倍及10<'3>倍，對臨床樣本中DPV的檢出率顯著高于傳統(tǒng)PCR。結(jié)果說明，本研究成功建立了準(zhǔn)確定量和快速檢測DPV的real-time PCR方法，為DPV的致病機(jī)制研究提供了有用的工具，為DPV的快速實(shí)驗(yàn)室診斷、大規(guī)模檢疫和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)手段。 2．鴨瘟病毒在體內(nèi)的動態(tài)定量分布及其潛伏部位研究為探明DPV的組織細(xì)胞嗜性及其潛伏感

5、染的部位，對人工感染后DPV在各器官的載量進(jìn)行了動態(tài)定量分析。結(jié)果表明，DPV在肝、脾、外周血淋巴細(xì)胞(PBL)、法氏囊(BF)、三叉神經(jīng)節(jié)(TG)、腎、肺和心臟等器官均能增殖，為一種泛嗜性病毒；動態(tài)定量分析發(fā)現(xiàn)，隨疾病發(fā)展，各器官病毒載量不斷上升，至死亡時達(dá)到頂峰；肝、脾、PBL中病毒載量高，為DPV的主要靶器官；耐過存活鴨多數(shù)器官中病毒逐漸消失，但感染后38d仍能從TG及PBL中檢測到低拷貝病毒DNA。研究結(jié)果說明，DPV作為泛嗜性

6、病毒，其感染后對各器官的侵害，特別是對免疫器官和免疫細(xì)胞的侵襲造成的免疫功能受損可能是其致病的重要原因之一；結(jié)果同時表明DPV能形成潛伏感染，除TG外，PBL也極有可能是其重要的潛伏部位。這些結(jié)論為DPV的致病機(jī)理及防制提供了重要的理論依據(jù)。 3．鴨瘟病毒強(qiáng)、弱毒株感染誘導(dǎo)α干擾素mRNA表達(dá)水平的定量分析 本研究建立了能評價鴨IFN-αmRNA表達(dá)水平變化的real-timePCR技術(shù)，并與DPV real-time

7、 PCR方法結(jié)合，對DPV強(qiáng)、弱毒株感染后肝細(xì)胞及PBL中IFN-αmRNA表達(dá)水平進(jìn)行了動態(tài)定量研究。結(jié)果表明，DPV疫苗弱毒株C-KCE感染能快速誘導(dǎo)肝細(xì)胞高水平表達(dá)IFN-αmRNA，且能長時間維持，病毒在肝細(xì)胞中的載量與IFN-αmRNA水平相對一致:C-KCE不能在PBL中增殖，也不能誘導(dǎo)其IFN-αmRNA水平的變化;強(qiáng)毒株DPV-F34在感染初期(1-9h)能誘導(dǎo)PBL中IFN-αmRNA的高水平表達(dá)，但隨著病毒載量的快速

8、增加，IFN-αmRNA表達(dá)急劇下降，至死亡時一直保持極低水平；DPV-F34感染后在肝細(xì)胞中增殖較快，其IFN-αmRNA表達(dá)沒有明顯上升或規(guī)律性的變化。這些結(jié)果表明，接種疫苗弱毒株可誘導(dǎo)IFN-α高水平表達(dá)，這可能是采用疫苗緊急接種后，在抗體水平較低的情況下能抵抗某些野毒感染的原因之一;強(qiáng)毒株感染后對肝細(xì)胞及PBL的破壞及造成的IFN-α表達(dá)抑制是其致病的機(jī)理之一。 4.基于real-time PCR技術(shù)的抗DPV體外藥效

9、評價本研究建立了采用real-time PCR技術(shù)在體外評價藥物抗DPV效果的方法，并測定了幾種抗病毒藥物的體外抗DPV作用。結(jié)果顯示，該方法具有客觀、準(zhǔn)確、快速、高通量等特點(diǎn)；阿昔洛韋能有效抑制DPV的增殖。研究結(jié)果為抗DPV藥物篩選提供了一種有效的技術(shù)平臺，同時為阿昔洛韋制劑作為一種有效的抗DPV藥物用于其感染的防治提供了依據(jù)。 上述研究的結(jié)果不僅為DPV的快速檢測、大規(guī)模檢疫及致病機(jī)理研究提供了有效的技術(shù)手段，同時，通過