新型轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2對肝癌細(xì)胞系中AFP的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的： 探討新型轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2抑制肝癌細(xì)胞系中AFP表達(dá)的作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為研究肝臟特異性基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和尋找新的肝癌臨床檢測指標(biāo)奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 一、新型轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2的克隆表達(dá) 1．融合表達(dá)載體pEGFP-ZHX2、pcDNA-ZHX2-HA的構(gòu)建設(shè)計兩對ZHX2特異性引物，分別包含EcoR Ⅰ、Sac Ⅱ酶切位點(diǎn)和Kpn Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)，其中后一對

2、中的下游引物含有HA-tag序列。以人肝mRNA為模板，PCR擴(kuò)增人ZHX2的基因和ZHX2-HA基因，PCR產(chǎn)物分別經(jīng)EcoR Ⅰ、SacⅡ和Kpn Ⅰ、EcoR Ⅰ雙酶切，回收后分別克隆入pEGFP-N1載體和pcDNA3.0載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，LA平板篩選挑取陽性重組子，并經(jīng)酶切、PER、DNA測序分析鑒定。 2．熒光顯微鏡和Western blot方法檢測ZHX2蛋白水平的表達(dá)pEGFP-ZHX2轉(zhuǎn)染后

3、48h，熒光顯微鏡觀察其在COS-7中的表達(dá)情況：pcDNA-ZHX2-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，提取總蛋白質(zhì)，western blot分析ZHX2-HA蛋白的表達(dá)情況。 二、ZHX2蛋白在肝癌細(xì)胞系中對AFP的抑制作用研究 1．ELISA和RT-PER檢測不同細(xì)胞系中AFP和ZHX2 mRNA的表達(dá)同等量的細(xì)胞(HepG2、HepG2.215、SMMC7721、LO2、SW480、MCF-7)在24孔板內(nèi)培養(yǎng)48h后，

4、收集細(xì)胞上清，ELISA方法檢測其AFP的表達(dá)量，BCG法檢測其對應(yīng)的白蛋白(ALB)表達(dá)量。同時提取細(xì)胞總RNA，RT-PER分析各細(xì)胞系ZHX2 mRNA的表達(dá)。 2．肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2.215中過量表達(dá)ZHX2對AFP的影響不同量pcDNA-ZHX2-HA(0、0.25、0.5、lug)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2.215，48h后，收集細(xì)胞上清，ELISA檢測其中AFP、ALB的表達(dá)情況。同時Wes

5、tern blot分析細(xì)胞中ZHX2－HA蛋白的表達(dá)情況。 3．針對ZHX2的SiRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建及其對ZHX2的抑制效果由廣州綠陽公司設(shè)計并合成了兩對針對ZHX2 cDNA序列的寡核苷酸，退火后克隆入含有H1啟動子的pSilencer<'TM>3.1-H1 neo載體，構(gòu)建針對ZHX2的siRNA表達(dá)載體ps1674和ps2360，重組子經(jīng)測序鑒定。 pcDNA-ZHX2-HA分別與ps1674、ps2360、

6、陰性對照 (negative control) 和pSilencer3.1空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并設(shè)立空細(xì)胞對照組，48h后，Westernblot分析細(xì)胞中ZHX2-HA蛋白的表達(dá)情況，從而檢測siRNAs的干擾作用。 4．ELISA和RT-PCR分別分析SiRNAs干擾ZHX2后AFP和ZHX2 mRNA的變化SiRNAs及其陰性對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞SMMC7721和正常肝永生化細(xì)胞L02，并設(shè)立空細(xì)胞對照，56h

7、后，檢測細(xì)胞上清中AFP的變化，并同時RT-PCR檢測細(xì)胞中ZHX2的表達(dá)情況。 三、ZHX2蛋白對AFP啟動子抑制作用機(jī)制的初步探討 1.構(gòu)建含有AFP啟動子核心區(qū)的報告質(zhì)粒首先設(shè)計包含有KpnI和XhoI酶切位點(diǎn)的針對AFP啟動子核心區(qū)的特異性引物(AFP-F和AFP-R)，以人基因組為模板，PCR擴(kuò)增人AFP啟動子的核心序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)KpnI和XhoI雙酶切，回收后克隆入pGL3-Basic載體，構(gòu)建報告質(zhì)粒D

8、hAF269，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，LA平板篩選挑取陽性重組子，并經(jīng)PCR、DNA測序分析鑒定。 2.phAF269的活性和特異性檢測phAF269、ph5040(陽性對照，由日本Hidekazu Nakabayashi博士(Departmentof Biochemistry，Hokkaido University School of Medicine)惠贈。)、pGL3-Basic(陰性對照)分別轉(zhuǎn)染HepG2和CO

9、S-7，同時每孔轉(zhuǎn)染pRL-TK 20ng作為轉(zhuǎn)染率內(nèi)參照，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶檢測實驗。 3．新型轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2對AFP啟動子核心區(qū)的抑制作用不同量的重組質(zhì)粒pcDNA-ZHX2-HA(0μg、0.1μg、0.2μg、0.3 μg、0.4μg)，分別與0.6μg phAF269質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞(各孔以pCDNA3.0 DNA將質(zhì)粒補(bǔ)足至1μg)，同時每孔轉(zhuǎn)染pRL-TK 20ng做為轉(zhuǎn)染率內(nèi)

10、參照。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶檢測實驗。 4.構(gòu)建含有AFP啟動子核心區(qū)突變體的報告質(zhì)粒設(shè)計兩個含有HNFl突變位點(diǎn)的針對AFP啟動子核心區(qū)的特異性下游引物AFP-A1-R和AFP-A2-R。 5．雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)尋找ZHX2與AFP啟動子核心區(qū)的作用位點(diǎn)含有AFP啟動子核心區(qū)突變體的報告質(zhì)粒(0.6μg)，與pcDNA-ZHX2-HA(0.3μg)共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，進(jìn)行雙熒

11、光素酶檢測實驗。 6．雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)檢測 按雙報告基因試劑盒說明書將細(xì)胞裂解后與底物混合，用熒光計數(shù)儀檢測熒光強(qiáng)度M1與熒光強(qiáng)度M2。以M1、M2比值表示熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度。每次實驗設(shè)2個復(fù)孔，同一轉(zhuǎn)染實驗至少重復(fù)3次。 7．統(tǒng)計分析 采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，各組間比較采用t檢驗進(jìn)行處理，當(dāng)P<0.05時，統(tǒng)計學(xué)上具備顯著性差異。 研究結(jié)果 一

12、、新型轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2的克隆表達(dá)。 二、ZHX2蛋白抑制肝癌細(xì)胞系中AFP表達(dá)。 三、ZHX2蛋白對AFP啟動子抑制作用機(jī)制的初步探討。 結(jié)論及意義： 本研究成功構(gòu)建了兩種可以在體外有效表達(dá)ZHX2融合蛋白的表達(dá)載體pEGFP-ZHX2和pcDNA-ZHX2-HA，瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，利用熒光顯微鏡和western blot檢測到了融合蛋白的表達(dá)，克服了目前尚沒有ZHX2抗體的困難，為進(jìn)一步研究