乙型肝炎病毒基因分型方法的建立.pdf

1、【研究背景】
　　乙型肝炎病毒HBV（hepatitisBvirus）是指引起人類急、慢性肝炎的DNA病毒，也稱丹氏顆粒。HBV基因組（HBV-DNA）由雙鏈不完全環(huán)形結(jié)構(gòu)的DNA組成，含約3200個(gè)核苷酸，主要分為P、C、X、S四個(gè)區(qū)。HBVDNA具有高度突變性，并由此形成了HBVDNA不同的亞型。研究發(fā)現(xiàn)高度重疊性和mRNA逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制中間體是其高突變的主要誘因。根據(jù)全基因序列異質(zhì)性≥8％且同源性<92％，將其分為8個(gè)基因型（A

2、、B、C、D、E、F、G、H）。目前對(duì)HBV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)是全基因組測(cè)序，之后根據(jù)HBV基因全序列比對(duì)，產(chǎn)生了S基因區(qū)分型標(biāo)準(zhǔn)，即通過(guò)比對(duì)HBV基因組的S基因區(qū)，以異質(zhì)性≥4％且同源性<96％進(jìn)行分型，S區(qū)具有較高的保守性，因此S基因區(qū)分型標(biāo)準(zhǔn)不僅具有分型有效性，并且對(duì)全基因組分型方法進(jìn)行了簡(jiǎn)化和優(yōu)化。
　　我國(guó)是乙肝發(fā)病大國(guó)，就目前的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)來(lái)看，中國(guó)的乙肝基因型主要為A、B、C、D這四種基因型，并且發(fā)現(xiàn)了不同基因型的HB

3、V的致病性所存在的差異，其基因型與乙型肝炎病情的進(jìn)展、臨床表現(xiàn)、治療耐藥、預(yù)后有著密切的關(guān)系。然而對(duì)于HBV的早期檢測(cè)和分型，至今仍無(wú)準(zhǔn)確有效的檢測(cè)方法，因此，建立一種高效、準(zhǔn)確、易于普及的對(duì)HBV進(jìn)行基因型分析的方法有利于我國(guó)衛(wèi)生事業(yè)對(duì)乙型肝炎的治療前診斷和治療實(shí)施。
　　【研究方法】
　　本實(shí)驗(yàn)立足于對(duì)HBV進(jìn)行基因分型，通過(guò)生物信息學(xué)分析比對(duì)了全球49個(gè)HBV全基因，其中包括14個(gè)NCBI中作為參考標(biāo)準(zhǔn)的HBV標(biāo)準(zhǔn)株基

4、因型，另外將此結(jié)果同時(shí)與中國(guó)提交給Genbank的部分HBV全基因比較，最終選擇HBV病毒8種基因型的PreS2和S區(qū)共同保守序列進(jìn)行擴(kuò)增，并在選擇的區(qū)域中進(jìn)一步挑選每種基因型特有的檢測(cè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)探針，采用反向核酸雜交技術(shù)，結(jié)合BAS通過(guò)ABS-ELISA和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)擴(kuò)增的PreS2和S區(qū)檢測(cè)片段進(jìn)行快速雜交反應(yīng)，建立一種新型SNP位點(diǎn)檢測(cè)方法，進(jìn)而完成對(duì)HBV基因型別的區(qū)分。
　　【研究結(jié)果】
　　1證實(shí)PreS2

5、、PreS1、S基因區(qū)具有重要的分型意義
　　通過(guò)大規(guī)模多重比對(duì)HBV基因組序列，發(fā)現(xiàn)HBVDNA的S區(qū)具有型內(nèi)高度保守、型間差異性大的位點(diǎn)，且這些位點(diǎn)在HBV基因組高突變情況下仍然可作為分型依據(jù)。同時(shí)在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)序比對(duì)過(guò)程中，證實(shí)了這些位點(diǎn)的高度保守性和型間差異性。而相對(duì)于P區(qū)、C區(qū)和X區(qū)比較，均未發(fā)現(xiàn)較高的連續(xù)型內(nèi)保守區(qū)段。證明S基因區(qū)對(duì)HBV基因型具有重要的分型意義。
　　2獲得西安地區(qū)HBV基因型分布趨勢(shì)
　

6、　通過(guò)對(duì)282例西安地區(qū)乙肝患者抽取血清并提取HBVDNA進(jìn)行構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品并測(cè)序比對(duì)其HBV基因型，獲得了的西安地區(qū)乙肝感染者的HBV基因型分布比例，未見(jiàn)A型，B型占14.5％，C型占81.9％，D型占3.6％，此統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)不同于以往流病調(diào)查的B型和C型比例相近的結(jié)果，有文獻(xiàn)稱HBVC型較HBVB型患者繼發(fā)肝硬化、肝癌的比例要高，此實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可通過(guò)對(duì)采血病人進(jìn)行追蹤調(diào)查證實(shí)HBV患者繼發(fā)癥和HBV基因型的關(guān)系。
　　3建立了一種具有

7、高效、快速、準(zhǔn)確優(yōu)勢(shì)的分型方法
　　此方法同其他HBV的分型檢測(cè)方法相比，可以針對(duì)單堿基進(jìn)行區(qū)分檢測(cè)，其靈敏度不遜色于其他方法依賴機(jī)器的檢測(cè)；不依賴于高昂的設(shè)備和嚴(yán)格的反應(yīng)條件，比其他方法更容易推廣；該方法檢測(cè)具有較快的檢測(cè)速度同時(shí)檢測(cè)條件簡(jiǎn)便，水浴條件下雜交即可完成檢測(cè)，通過(guò)擴(kuò)大單個(gè)膜塊面積和相應(yīng)增多探針數(shù)量則可完成高通量檢測(cè)；該方法的檢測(cè)范圍就HBV分型已經(jīng)完成630bp長(zhǎng)度的片段捕獲，更利于探針設(shè)計(jì)和樣本制備。
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