血清中LeY腫瘤抗原的測(cè)定及其臨床意義.pdf

1、目的：路易斯抗原Y（Lewis antigen Y，LeY）是一種血型相關(guān)抗原，是結(jié)合于一些糖蛋白和糖脂末端的寡糖，在60-90%上皮來(lái)源的腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等惡變程度密切相關(guān)。含LeY的糖蛋白或糖脂可分泌或脫落至血液中。本文目的是建立一種適合臨床檢驗(yàn)的血清學(xué)診斷方法，分析血清中LeY的表達(dá)情況，為臨床腫瘤診斷提供依據(jù)。 方法：本實(shí)驗(yàn)擬建立的LeY在人血清中檢測(cè)的方法如下： 一、病例選擇： 選擇腫

2、瘤患者血清169例，包括乳腺癌、卵巢癌，直腸癌、肺癌、胃癌和膀胱癌，以及正常人血清200例為陰性對(duì)照。 二、ELISA雙抗夾心方法的建立： 1.ELISA一般步驟 （1）小鼠抗人抗體BG-8包被；（2）3%BSA液封閉；（3）加入待檢血清，并設(shè)置空白、陰性、陽(yáng)性對(duì)照；（4）加入酶標(biāo)荊豆凝集素UEA-1抗體；（5）加入底物顯色；（6）加入終止液；（7）測(cè)定OD450nm值。 2.條件優(yōu)化 （1）BG

3、-8抗體稀釋度的確定：將BG-8抗體稀釋成1：2000、1：1000、1：500、1：200、1：100五個(gè)不同濃度，按ELISA步驟，對(duì)OD450nm值作圖，確定最佳濃度。 （2）酶標(biāo)凝集素最佳濃度測(cè)定：將酶標(biāo)UEA-1配制成1μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg，按照ELISA步驟，對(duì)OD450nm值作圖，確定最佳濃度。 （3）陽(yáng)性對(duì)照濃度的確定：將人子宮內(nèi)膜移行上皮細(xì)胞癌細(xì)胞裂解液A431稀釋成1：400、

4、1：100、1：50、1：10、1：2五個(gè)濃度，按ELISA步驟，對(duì)OD450nm值作圖，確定最佳濃度。 （4）反應(yīng)時(shí)間的選擇：按照ELISA步驟，改變各步反應(yīng)時(shí)間，比較不同時(shí)間OD450nm值，確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時(shí)間。 3.測(cè)定：按照已確定的條件用ELISA央心法測(cè)定不同腫瘤患者血清LeY的OD450nm值。用Westen blot法分析正常血清組及病人組LeY糖蛋白表達(dá)譜。 結(jié)果：1.條件優(yōu)化：確定包被一抗和酶標(biāo)

5、凝集素二抗的工作濃度分別為：1：500、2.5μg/ml；陽(yáng)性對(duì)照A431細(xì)胞蛋白裂解液工作濃度為1：50。包被條件為4℃36小時(shí)；血清反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)；封閉時(shí)間為1小時(shí)；顯色時(shí)間為20分鐘。2.結(jié)果分析：（1）正常人檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以LeY標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml不同濃度作圖，經(jīng)回歸分析做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸系

6、數(shù)r=0.966。將待測(cè)樣品平均OD450nm值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，確定LeY含量。（2）將正常人和不同腫瘤患者之間測(cè)定值用Spss11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，分析線性關(guān)系及相關(guān)性。3.各組血清LeY測(cè)定結(jié)果為：乳腺癌：（156.81±46.93）ng/ml，卵巢癌：（176.90±50.71）ng/ml，直腸癌：（119.70±38.82）ng/ml，肺癌：（55.58±35.02）ng/ml，胃癌：（66.40±33.51）ng/ml

7、，膀胱癌：（79.44±41.28）ng/ml，正常人：（35.17±22.49）ng/ml。實(shí)驗(yàn)組腫瘤血清LeY水平均明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；其中乳腺癌、卵巢癌組和直腸癌組與正常人組血清LeY水平差異較其他腫瘤組與正常人血清LeY水平差異更為明顯。Westen blot法顯示腫瘤組陽(yáng)性條帶檢出率均高于正常組，乳腺癌、卵巢癌和直腸癌條帶檢出率顯著高于其他癌組。 結(jié)論：1.所建立的ELISA夾心法具有靈