缺氧條件下肝癌細胞中基因DEC1、HIF-1α、PCNA、Survivin差異表達的研究及其意義.pdf

1、癌癥是世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)公布的數(shù)據(jù)顯示，每年全球約有800萬人死于癌癥。目前我國腫瘤防控面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，惡性腫瘤已成為居民最大的健康殺手，腫瘤發(fā)病率明顯增高。每年新發(fā)癌癥人數(shù)280萬，死于癌癥人數(shù)190萬。而肝癌死亡率在全國惡性腫瘤死亡率中排在第二位。雖然目前對于肝癌的治療方案已經(jīng)日趨完善，但是往往治療效果較差，目前肝癌的發(fā)生發(fā)展及其侵襲機制仍未明確，對肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究一直是生命科學(xué)以及醫(yī)學(xué)界研究的熱點

2、問題。因此對于肝癌發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面的研究，并從中尋找具有針對性靶向性的干預(yù)位點，從而進行定向靶位治療的方法探索是臨床研究的一大挑戰(zhàn)。
　　 分化型胚胎軟骨發(fā)育基因1(Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene1，DEC1)在1997年首次發(fā)現(xiàn)于人類胚胎軟骨組織中。DEC1蛋白屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)類轉(zhuǎn)錄因子家

3、族，在細胞的增殖與分化、淋巴細胞的成熟、調(diào)節(jié)分子時鐘節(jié)律、脂類代謝、細胞的凋亡、缺氧反應(yīng)、免疫耐受以及腫瘤形成等機體生理功能中發(fā)揮重要作用。DEC1蛋白廣泛表達于人類大多數(shù)正常組織以及多種腫瘤組織中，如非小細胞肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌，但是在肝癌細胞系中的表達以及缺氧條件下的表達情況仍未明了.
　　 多項研究發(fā)現(xiàn)DEC1的表達與缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia induce factor-1α，HIF-1α)有密切聯(lián)系

4、，在對乳腺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、腎癌膀胱癌、胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧可以誘導(dǎo)DEC1的高表達，DEC1與HIF-1α的表達具有顯著相關(guān)性。而在肝癌細胞系中DEC1與HIF-1α的表達情況仍無研究。
　　 增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)是一種僅出現(xiàn)在增殖狀態(tài)細胞核內(nèi)的酸性蛋白質(zhì)，其量的變化與DNA合成一致，具有一定的周期性，檢測其在細胞中的表達可作為評價細胞增殖

5、狀態(tài)的一個指標(biāo)。Survivin為凋亡抑制基因，是凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein，IAP)家族一員，具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖以及浸潤轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系。我們通過選取PCNA與Survivin作為反應(yīng)細胞增殖凋亡指標(biāo)，來初步探討DEC1在缺氧條件下對原發(fā)性肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 目的：
　　 本實驗以肝癌細胞系Bei-7402、

6、HepG2及正常人肝細胞系QSG-7701為研究對象，探討正常氧條件及模擬缺氧條件下基因DEC1、HIF-1α、PCNA及Survivin在肝癌細胞系和正常肝細胞系中的表達情況，初步探討DEC1在原發(fā)性肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法：
　　 1.實時熒光定量PCR檢測肝癌細胞系Bel-7402、HepG2及正常人肝細胞系QSG-7701中DEC1、HIF-1α、PCNA及Survivin基因mRNA在正常及缺氧

7、條件下的表達情況。
　　 2.應(yīng)用細胞免疫化學(xué)染色的方法檢測正常及缺氧24 h條件下肝癌細胞系Bel-7402、HepG2中DEC1、HIF-1α、PCNA及Survivin蛋白的表達定位。
　　 3.以正常人肝細胞系QSG-7701為對照，采用Western Blot方法比較DEC1蛋白在正常人肝細胞與肝癌細胞系中的表達情況。檢測缺氧條件下肝癌細胞中DEC1、HIF-1α、PCNA、Survivin蛋白水平的表達。

8、r>　　 結(jié)果：
　　 1.在正常氧含量條件下，肝癌細胞系Bel-7402、HepG2細胞中DEC1、HIF-1α、PCAN、Survivin基因的mRNA的表達量明顯高于正常人肝細胞系QSG-7701。
　　 2.缺氧條件下，肝癌細胞系Bel-7402、HepG2和正常人肝細胞系QSG-7701中DEC1基因mRNA顯著高表達。肝癌細胞系Bel-7402、正常人肝細胞系QSG-7701中HIF-1α基因mRNA的表達

9、沒有顯著性差異;肝癌細胞系HepG2細胞中HIF-1α基因mRNA的表達除6h組沒有顯著性差異外，3h、12h和24 h均顯著高于0h正常對照組。
　　 3.正常人肝細胞系QSG-7701中PCNA基因mRNA的表達變化沒有顯著性差異;肝癌細胞系Bel-7402中PCNA基因mRNA表達除缺氧24 h組有顯著性差異外，其他各組均無顯著性差異;而肝癌細胞系HepG2細胞中PCNA基因mRNA的表達除了3h組外，6h、12h、24

10、h組均顯著性增高。肝癌細胞系Bel-7402、HepG2以及正常人肝細胞系QSG-7701中，Survivin基因的mRNA的表達在缺氧培養(yǎng)調(diào)件下沒有顯著性差異。
　　 4.細胞免疫化學(xué)染色顯示，棕黃色顆粒為陽性顆粒，肝癌細胞系Bel-7402、HepG2中DEC1、HIF-1α蛋白在細胞核和細胞漿中都有表達，而PCNA、Survivin蛋白主要表達于細胞核中。
　　 5.在正常氧含量條件下，肝癌細胞系Bel-7402、

11、HepG2細胞中DEC1蛋白的表達量明顯高于正常肝細胞系QSG-7701。在缺氧培養(yǎng)條件下，肝癌細胞系Bel-7402中DEC1、HIF-1α、PCNA蛋白缺氧組的表達顯著高于0h正常對照組，Survivin蛋白在缺氧12h后其表達量顯著性增高。肝癌細胞系HepG2細胞中HIF-1α、PCNA蛋白缺氧組的表達顯著高于0h正常對照組，DEC1、Survivin蛋白在3h、6h、24 h組表達量顯著高于0 h正常對照組，而12h組與0h組比