豬偽狂犬病毒變異毒株鑒別診斷PCR方法建立與基因缺失滅活疫苗免疫保護效力研究.pdf

1、豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一種豬的急性傳染病，臨床上主要引起母豬的繁殖障礙、產(chǎn)死胎或木乃伊胎，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，最后轉(zhuǎn)歸于死亡。近30年來我國廣泛應用PRV基因缺失疫苗，使該病得到有效控制。但2011年底該病毒再次爆發(fā)流行，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了空前巨大的損失。多個研究報告證明，該流行毒株毒力增強，抗原性發(fā)生明顯變異。本研究通過對偽狂犬病的病原學與血清學

2、檢測，證明了該病在華東地區(qū)發(fā)生流行，成功建立了偽狂犬病毒經(jīng)典毒株與變異毒株PCR鑒別診斷方法，并制備偽狂犬變異毒株基因缺失滅活疫苗，進行了免疫效果測定，為該病防控奠定了重要基礎。本研究包括以下3個部分:
　　1.華東地區(qū)豬偽狂犬病流行病學調(diào)查與流行毒株分離鑒定
　　為了解豬偽狂犬病在華東地區(qū)發(fā)生與感染狀況，本研究對2012-2015年江蘇、山東、浙江和安徽四省進行了偽狂犬病血清學和病原學的流行病學調(diào)查與PRV流行毒株分離鑒定

3、，結(jié)果為:(1)血清抗體:血清PRV gB抗體陽性率平均為92.3％(7119/7716); gE抗體陽性率從2012年的0％上升到2014年的34.9％，2015年降至31.6％，平均抗體陽性率達到30.7％(2189/7130)。在參與調(diào)查的4個省中浙江省陽性率最高，達到了42.1％，安徽最低，為24％。gE豬場陽性率2012-2015年分別為:0％、40.8％、55.0％、65.0％，平均陽性率為52.6％(162/308)，其中

4、2014年4個省的豬場陽性率均為100％。(2)PRV PCR檢測:2013-2015年PRV野毒感染率分別為14.1％、24.9％、28.9％，平均感染率為25.1％(121/481);豬場陽性率分別為:22.7％、36.5％、40.5％，平均豬場陽性率為37.3％。(3)病毒分離鑒定:從4份偽狂犬陽性病料中分離出4株病毒，經(jīng)PCR鑒定均屬于偽狂犬病毒流行毒株。以上數(shù)據(jù)表明偽狂犬病毒在華東地區(qū)廣泛流行，為該病防控提供了理論依據(jù)。

5、>　　2.鑒別偽狂犬經(jīng)典毒株與變異毒株的PCR方法的建立
　　為了有效區(qū)分變異毒株和經(jīng)典毒株，根據(jù)國內(nèi)外偽狂犬病毒(PRV)變異毒株和經(jīng)典毒株基因序列比對結(jié)果，針對UL44和UL36區(qū)域的基因序列設計了兩對引物，建立兩步法PCR。第一步PCR針對UL44區(qū)域，區(qū)分出經(jīng)典毒株（疫苗株HB98除外）感染與變異毒株感染。第二步PCR針對UL36區(qū)域，區(qū)分出HB98與偽狂犬變異毒株。兩步法PCR的敏感度分別達到2-20 TCID50和50

6、TCID50病毒量。對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、日本腦炎病毒、腦心肌炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的核酸應用此方法進行擴增，結(jié)果均為陰性。該方法與豬偽狂犬病毒國家標準PCR檢測方法的符合率達到91％，可用于該病實驗室快速診斷。
　　3.豬偽狂犬病毒gE/gI缺失滅活疫苗制備與免疫保護效力試驗
　　本研究通過對偽狂犬病病毒gE/gI雙基因缺失毒株rZJ01△gE/gI進行滅活條件優(yōu)化，采用3種不同佐劑制成滅活

7、疫苗。小鼠免疫保護試驗結(jié)果表明，甲醛滅活后輔以15A佐劑制成的疫苗（rZJ01/F/15A）免疫效果最好，一次免疫后3周即可產(chǎn)生較高水平PRV gB ELISA抗體，二次免疫后3周中和抗體效價達1∶158。豬體免疫保護試驗結(jié)果表明，甲醛滅活輔以206佐劑制成的疫苗(rZJ01/F/206)免疫保護效果最好，一次免疫后3周即可產(chǎn)生較高水平的PRV gB ELISA抗體和中和抗體，二次免疫后2周gB抗體與中和抗體效價達1∶256。二次免疫后