卵巢癌鉑類化療耐藥相關(guān)蛋白annexin A3外分泌方式及其作用機(jī)制探討.pdf

1、研究背景:
　　 卵巢癌是婦科惡性腫瘤中首位致死性疾病。在理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔助鉑類藥物為主的聯(lián)合化療是臨床規(guī)范的治療手段。然而順鉑和卡鉑作為最常用的一線化療藥物,其原發(fā)或繼發(fā)耐藥性的產(chǎn)生是卵巢癌治療的主要障礙,也是晚期(Ⅲ或Ⅳ期)卵巢癌患者五年生存率較低(20～30％)的主要原因之一。目前對于鉑類化療藥物抗腫瘤作用機(jī)制的研究已經(jīng)較為深入,但對其耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)相對處于初級階段,進(jìn)一步預(yù)測鉑類化療耐藥的工作則更是剛

2、剛起步。早期對于鉑類化療藥物耐藥研究集中于調(diào)節(jié)耐藥的基因及分子機(jī)制。近年來則更多的關(guān)注于鉑類耐藥的細(xì)胞外基質(zhì)及新耐藥相關(guān)蛋白的探索。
　　 本課題組自2003年起開展對卵巢上皮癌鉑類化療耐藥相關(guān)蛋白的研究。運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),篩選出5種鉑類化療耐藥相關(guān)蛋白(Annexin A3、Destrin、IDHc、GSTO1-1和Cofilin1),其中annexin A3因其在全部卵巢癌鉑類耐藥細(xì)胞中獲得共表達(dá),顯著上調(diào),成為本課題

3、組進(jìn)行鉑類耐藥研究的目標(biāo)蛋白。經(jīng)免疫組織化學(xué)驗(yàn)證,annexin A3在臨床卵巢癌鉑類耐藥患者的腫瘤組織中表達(dá)明顯升高,annexin A3高表達(dá)組的無瘤生存期顯著縮短。動(dòng)物試驗(yàn)表明,annexin A3高表達(dá)細(xì)胞,在順鉑作用后裸鼠成瘤率明顯上升。進(jìn)一步運(yùn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),上調(diào)annexin A3的表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)annexin A3能夠降低細(xì)胞內(nèi)鉑含量及鉑-DNA結(jié)合量。annexin A3高表達(dá)的細(xì)胞對鉑類化療藥物的耐藥性顯著增強(qiáng),但是對

4、紫杉醇、表阿霉素等藥物無交叉耐藥性,提示annexin A3可能是鉑類特異性耐藥相關(guān)蛋白。此外,annexin A3降低卵巢癌細(xì)胞P53水平。
　　 基于以上研究結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)旨在探討annexin A3成為臨床卵巢癌鉑類化療耐藥標(biāo)記蛋白的可能性。在獲得annexin A3穩(wěn)定高表達(dá)或低表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系基礎(chǔ)上,運(yùn)用Western blot技術(shù),檢測卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中annexin A3的表達(dá)。采用ELISA分析法檢測annex

5、in A3在臨床卵巢癌患者血清中的表達(dá),分析annexin A3外泌水平與卵巢癌鉑類耐藥的相關(guān)性。通過透射電鏡及免疫電鏡觀察annexin A3表達(dá)上調(diào)及外分泌的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。進(jìn)一步探討annexin A3外泌的作用及其誘導(dǎo)細(xì)胞對鉑耐藥的生物學(xué)機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1、運(yùn)用正義annexin A3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染順鉑敏感卵巢癌細(xì)胞,獲得annexin A3穩(wěn)定表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞克隆；同時(shí)運(yùn)用反義annexin A3質(zhì)粒下調(diào)順

6、鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞內(nèi)annexin A3水平,獲得annexin A3穩(wěn)定表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞克隆。采用免疫熒光激光共聚交技術(shù)檢測annexin A3表達(dá)水平的變化,以及在細(xì)胞內(nèi)的定位。收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清,采用免疫印跡技術(shù)檢測培養(yǎng)基上清中annexin A3的表達(dá),同時(shí)比較其外泌水平與細(xì)胞內(nèi)annexin A3表達(dá)水平、細(xì)胞耐藥性的關(guān)系。收集臨床卵巢癌患者手術(shù)前血清50例,以ELISA法檢測annexin A3在人外周血中的表達(dá)水平。
　

7、　 2、采用Signal—P等軟件分析annexin A3的分子結(jié)構(gòu)。透射電鏡觀察卵巢癌鉑類耐藥細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的特征,以及運(yùn)用siRNA瞬時(shí)下調(diào)順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞內(nèi)annexin A3表達(dá)水平后對于細(xì)胞形態(tài)的影響。以膠體金標(biāo)記annexin A3蛋白,運(yùn)用免疫電鏡觀察annexin A3在亞細(xì)胞器中的定位。進(jìn)一步收集annexin A3高表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)基上清,分別采用小量提取法和梯度離心法收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的exosome,選擇適合

8、本實(shí)驗(yàn)的exosome收集方法。根據(jù)exosome所含蛋白質(zhì)濃度對各卵巢癌細(xì)胞系分泌的exosome進(jìn)行定量,觀察annexin A3對exosome分泌數(shù)量的影響。
　　 3、利用電感耦合等離子質(zhì)譜法分別檢測細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞培養(yǎng)上清中、以及exosome內(nèi)的鉑含量。以CDDP至終濃度10μM分別作用卵巢癌鉑類敏感、耐藥、分別轉(zhuǎn)染正反義質(zhì)粒、以及siRNA下調(diào)annexin A3表達(dá)的細(xì)胞,于不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,觀察annexin

9、A3對卵巢癌細(xì)胞鉑吸收的影響。以CDDP至終濃度10μM分別作用上述細(xì)胞36小時(shí),更換無藥無血清培養(yǎng)基,于不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,觀察annexin A3對卵巢癌細(xì)胞鉑外流的影響。以CDDP至終濃度10μM分別作用上述細(xì)胞24小時(shí),更換無藥無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。梯度離心法收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的exosome,分析其中的鉑含量。
　　 4、收集臨床卵巢癌患者手術(shù)前血清50例,術(shù)后正規(guī)隨診至少1年。將所有卵巢癌患者分為鉑類化療耐

10、藥組和敏感組,同期收集本院體檢中心正常婦女血清30例作為對照。運(yùn)用ELISA法檢測卵巢癌患者及正常婦女血清中的annexin A3表達(dá)水平,探討外分泌蛋白annexin A3預(yù)測卵巢癌耐藥的敏感性和特異性。同時(shí)運(yùn)用生存分析方法繪制Kaplan-Meier曲線,分析血清中annexin A3蛋白表達(dá)水平與卵巢癌患者無瘤生存期的關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1、Annexin A3蛋白主要在卵巢癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá),在胞核內(nèi)無顯

11、著表現(xiàn),在胞膜無表達(dá)。在卵巢上皮癌細(xì)胞系的培養(yǎng)基上清中檢測出annexinA3蛋白表達(dá),其強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)annexin A3的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在臨床卵巢癌患者的外周血中檢測出annexin A3蛋白的表達(dá),充分證實(shí)annexin A3是一個(gè)可分泌蛋白。
　　 2、Annexin A3蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中不具備典型信號肽結(jié)構(gòu),不能經(jīng)過經(jīng)典的信號肽途徑分泌。經(jīng)過透射電鏡和免疫電鏡的分析,annexin A3蛋白在卵巢

12、癌耐藥細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯上調(diào)后,觀察到在細(xì)胞漿內(nèi)大量囊泡樣結(jié)構(gòu)的形成,囊泡樣小體與細(xì)胞膜的融合及分離,進(jìn)而在細(xì)胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)表達(dá)annexin A3蛋白的exosome小體,exosome的定量與胞漿內(nèi)annexin A3的表達(dá)水平呈正相關(guān)。上述研究結(jié)果揭示出annexin A3出胞完整的生物學(xué)過程,即細(xì)胞漿內(nèi)annexin A3的表達(dá)上調(diào)致使大量囊泡樣結(jié)構(gòu)的聚集,形成囊泡樣小體,小體與細(xì)胞膜融合脫離,繼而以exosome的形式完成an

13、nexin A3蛋白的外分泌。
　　 3、Annexin A3蛋白外泌與調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞對于鉑類耐藥的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)證明,Annexin A3蛋白的表達(dá)上調(diào)對于卵巢癌細(xì)胞對鉑的吸收過程沒有明顯的影響,但細(xì)胞對于鉑的釋放顯著增加。對exosome內(nèi)鉑濃度的測定結(jié)果表明,annexin A3蛋白外分泌過程將鉑離子帶出細(xì)胞外,從而使鉑類藥物不能與卵巢癌細(xì)胞的DNA相結(jié)合,產(chǎn)生耐藥性。
　　 4、小樣本的臨床研究表明,正常婦女組血