表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)Cap蛋白重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性鑒定.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus2, PCV2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的主要病原，在我國豬群中廣泛存在，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前用于防控 PCV2感染的疫苗主要包括滅活疫苗和亞單位疫苗。近年來，PCV2與偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）混合感染十分普遍，造成仔豬嚴(yán)重的呼吸系

2、統(tǒng)疾病以及母豬繁殖障礙，新出現(xiàn)的PRV變異強(qiáng)毒株給臨床防控提出新的挑戰(zhàn)和難題。本研究以PRV為病毒活載體，將PCV2 Cap蛋白基因插入PRV基因組內(nèi)，以期構(gòu)建能夠表達(dá)高水平PCV2 Cap蛋白的重組PRV病毒，旨在為這兩種病毒性疫病的防控提供一種基因工程疫苗。
　　研究表明，PRV胸苷激酶（TK）基因是病毒毒力相關(guān)基因，該基因缺失對病毒復(fù)制能力沒有明顯影響，但使其毒力大大降低。我們首選PRV TK基因作為靶點(diǎn)，在缺失該基因的同時(shí)

3、替換插入PCV2 Cap基因，構(gòu)建了一種表達(dá)PCV2 Cap蛋白基因的重組PRV TK缺失毒株。本研究構(gòu)建了2個(gè)重組轉(zhuǎn)移載體pMD18T-LR(TK)-EGFP和pMD18T-LR(TK)-Cap，前者包含缺失TK基因的左右同源臂和 EGFP表達(dá)盒，后者包含缺失 TK基因的左右同源臂和 Cap蛋白表達(dá)盒。將pMD18T-LR(TK)-EGFP和PRV-JF毒株的基因組DNA共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，經(jīng)同源重組方法用EGFP表達(dá)盒替換 TK基

4、因，經(jīng)綠色熒光蝕斑篩選和 PCR鑒定，篩選獲得缺失 TK基因的重組病毒rPRV-TK-/EGFP+。以該重組毒株為材料，經(jīng)同源重組方法用PCV2 Cap表達(dá)盒再替換EGFP表達(dá)盒，經(jīng)無綠色熒光蝕斑反式篩選和 PCR鑒定，獲得表達(dá) PCV2 Cap表達(dá)盒的重組病毒rPRV-TK-/Cap+。用PCV2 Cap蛋白特異性單克隆抗體進(jìn)行IPMA方法鑒定PCV2 Cap蛋白的表達(dá)，結(jié)果檢測不到Cap蛋白的表達(dá)，證實(shí)該重組毒株不能表達(dá)Cap蛋白，

5、分析可能與插入的位點(diǎn)或者表達(dá)盒有關(guān)。
　　為了進(jìn)一步構(gòu)建能高效表達(dá)PCV2 Cap蛋白的重組PRV，又以rPRV-TK-/Cap+重組病毒為材料，選擇PRV gE基因?yàn)樾碌牟迦氚悬c(diǎn)。首先構(gòu)建了2個(gè)重組轉(zhuǎn)移載體pMD18T-LR(gE)-EGFP和pMD18T-LR(gE)-Cap(CI)，前者包含缺失 gE基因的左右同源臂和 EGFP表達(dá)盒，后者包含缺失gE基因的左右同源臂和 Cap蛋白表達(dá)盒。將重組轉(zhuǎn)移載體 pMD18T-LR(

6、gE)-EGFP與重組病毒rPRV-TK-/Cap+基因組DNA共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，經(jīng)同源重組方法用EGFP表達(dá)盒替換gE基因，通過綠色熒光蝕斑篩選和PCR鑒定，獲得TK、gE雙基因缺失的重組毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/EGFP+。以該重組毒為材料，將重組轉(zhuǎn)移載體pMD18T-LR(gE)-Cap(CI)與其基因組DNA共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，經(jīng)無綠色熒光蝕斑反向篩選和PCR鑒定，獲得TK、gE雙基因缺失含有兩個(gè)Cap蛋白表達(dá)

7、盒的重組毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CI)。經(jīng)IPMA和Western blot試驗(yàn)檢測Cap蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示用Cap蛋白特異性單克隆抗體可以檢測到Cap蛋白的表達(dá)，表明該重組病毒能有效地表達(dá)Cap蛋白。為了進(jìn)一步增強(qiáng)Cap蛋白的表達(dá)量，本研究從改變Cap蛋白表達(dá)盒的啟動子和優(yōu)化Cap基因密碼子兩方面，經(jīng)同源重組方法構(gòu)建了攜帶 Cap蛋白復(fù)合啟動子表達(dá)盒的重組病毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(

8、CA)和攜帶 Cap蛋白密碼子優(yōu)化表達(dá)盒的重組病毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+opti(CA)。經(jīng)IPMA和Western blot檢測結(jié)果表明，上述兩種重組毒均可以有效地表達(dá) Cap蛋白，然而這3種重組毒株 rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CI)、rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CA)和rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+opti(CA) Cap表達(dá)量的差異并不顯著。一步生長曲線試驗(yàn)

9、結(jié)果顯示，這3種重組毒株生物學(xué)特性相似，但它們的生長動力學(xué)都比親本毒株P(guān)RV-JF的要弱。用構(gòu)建的重組毒株接種家兔顯示其毒力明顯降低，表明對家兔是安全的，具備了作為疫苗研制的可能。
　　UL42蛋白是PRV病毒DNA聚合酶的輔助亞基，對病毒復(fù)制是必需的。UL42的體外功能已被證實(shí)，有關(guān)UL42的單克隆抗體所識別的抗原表位到目前仍未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室制備了6株針對UL42蛋白的單抗(2D5、4E2、2G11、5F8、7C11和8F9)

10、，通過Western blot和ELISA方法對這些單抗識別的抗原表位進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，有兩個(gè)區(qū)域的氨基酸（aa）（39~148 aa和302~384 aa）能與UL42單抗反應(yīng)。通過合成一系列針對這兩個(gè)區(qū)域的短肽，最終鑒定出了這6株單抗能夠識別3個(gè)抗原表位，其中表位116SGGVLDALK124位于 UL42的氨基端，而354KRPAAPR360和360RMYTPIAK367位于UL42的羧基端。氨基酸序列分析顯示，這3個(gè)表位在不