重組Mash1慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、背景和目的： bHLH(basichelix-loop-helix，堿性螺旋一環(huán)一螺旋)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，廣泛參與神經(jīng)和肌肉發(fā)生、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞譜系的決定和性別決定等基本生理過(guò)程。Mashl(mammalianachaete-scutehomolog1)基因?qū)儆赽HLH轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族成員之一，在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)分化過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Mashl基因功能缺失導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育異常、神經(jīng)元

2、分化減少及特定亞型神經(jīng)元缺失；而其過(guò)表達(dá)則可以促進(jìn)P19細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。由于Mashl基因的過(guò)表達(dá)研究多數(shù)應(yīng)用的是質(zhì)粒型表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染效率較低且不能穩(wěn)定表達(dá)，如采用合適的載體將Mashl基因?qū)敫杉?xì)胞或體內(nèi)或?qū)⑥D(zhuǎn)染Mashl基因的靶細(xì)胞植入損傷局部，使其在損傷部位持續(xù)分泌Mashl蛋白，必將有利于神經(jīng)分化和神經(jīng)損傷的修復(fù)。因此，為進(jìn)一步探討Mashl基因在神經(jīng)發(fā)育和干細(xì)胞神經(jīng)分化中的調(diào)控作用及為基因治療神經(jīng)系

3、統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ)，我們擬構(gòu)建重組Mashl基因慢病毒表達(dá)載體。 實(shí)驗(yàn)方法： 1. MashlcDNA克隆及序列分析從小鼠胚胎中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增獲得小鼠Mashl基因，回收純化；以T4連接酶連接Mashl基因片段和pG酬一T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌JM109后經(jīng)藍(lán)白篩選和以T7／SP6為引物PCR擴(kuò)增篩選鑒定重組克?。恍√嶂亟M克隆質(zhì)粒DNA，應(yīng)用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和XholI對(duì)其進(jìn)一步酶切鑒定陽(yáng)性克

4、??；對(duì)鑒定出的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pGEM-T-Mashl進(jìn)行基因測(cè)序。 2．Mashl基因慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建接種pGEM-T—Mashl重組質(zhì)粒于LB(Amp+)液體培養(yǎng)基，提取此重組質(zhì)粒DNA并用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和Xh01I對(duì)其和LentiVirus載體雙酶切，分別回收純化，得到Mashl基因雙粘片段和LentiVirus)~~粘線性質(zhì)粒，以T4連接酶將二者連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌JM109。小提重組克隆質(zhì)粒DNA，BaEHI和X

5、holI雙酶切篩選鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒LentiVirus-Mashl。 3．慢病毒表達(dá)載體Lentivirus-Mashl的轉(zhuǎn)染和表達(dá)將LentiVirus-Mashl和輔助病毒載體共感染293T細(xì)胞，48小時(shí)后收集病毒顆粒：使病毒顆粒感染Eca-9706細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)；收集感染后的Eca-9706細(xì)胞及未感染的的Eca-9706細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)RT—PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Mash

6、lmRNA水平的表達(dá)。 結(jié)果： 1. Mashl基因克隆RT-PCR擴(kuò)增得到的cDNA片段為719bp，與GenBank中Mashl基因cDNA長(zhǎng)度一致。Mashl基因cDNA片段與克隆載體pGEM-TEasy連接后轉(zhuǎn)化，經(jīng)藍(lán)白篩選得到大量菌落，以T7／SP6為引物PCR擴(kuò)增鑒定及雙酶切鑒定得到陽(yáng)性重組克隆pGEM-T-Mashl，重組克隆的基因測(cè)序結(jié)果與GenBank中Mashl基因序列一致，二者堿基同源性達(dá)100％，

7、為相同的氨基酸編碼。 2．Mashl基因慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-Mashl和質(zhì)粒Lentivirus后得到的Mashl基因雙粘片段及雙粘Lentivirus線性質(zhì)粒連接后經(jīng)轉(zhuǎn)化，得到大量菌落，通過(guò)雙酶切鑒定得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒LentiVirus-Mashl。 3．Lentivirus-Mashl的轉(zhuǎn)染和表達(dá)Lentivirus-Mashl表達(dá)載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞產(chǎn)生病毒顆粒后，感染Eca一9706細(xì)胞，4