鬼臼毒素衍生物GMZ-1體外抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的:本文研究鬼臼毒素新型衍生物GMZ-1對腫瘤細胞的體外殺傷和抑制生長作用,并對其發(fā)揮作用的機制進行初步探索。
　　 方法:
　　 1、MTT法檢測GMZ-1的體外抗腫瘤活性：
　　 采用MTT法測定GMZ-1對多種腫瘤細胞(Hela、A549、MCF-7、HepG－2,SKOV3、BGC-823,MGC-803,KB、KBV200、K562,K562/A02)及正常細胞(FB)抑制作用的IC50值。
　

2、　 2、GMZ-1誘導腫瘤細胞凋亡的檢測：
　　 吉姆薩染色(Giemsa staining)和熒光染色(Heochst33342 staining)觀察GMZ-1 K562/A02細胞作用的形態(tài)學變化;瓊脂糖凝膠電泳觀察GMZ-1對KBV200細胞染色體DNA的影響;流式細胞術(FCM)測定經GMZ-1處理后K562/A02細胞凋亡率的變化。
　　 3、流式細胞術(FCM)分析GMZ-1對K562/A02細胞周期的影

3、響
　　 4、RT-PCR檢測GMZ-1對K562/A02細胞p21、p53、Bax、Caspase-3、PCNA、CyclinA、CyclinB1、Mdr-1基因mRNA表達的影響
　　 5、Western-blot檢測GMZ-1對K562/A02細胞Caspase-3、Mdr蛋白表達的影響
　　 6、GMZ-1對HepG-2細胞微管聚合的影響
　　 免疫熒光(Immunofluorescence)觀察

4、經GMZ-1處理后HepG-2細胞微管形態(tài)變化;熒光半定量測定GMZ-1對HepG-2細胞微管聚合影響的抑制率及IC50值。
　　 7、小鼠急性毒性試驗初步考察GMZ-1體內毒性
　　 結果:
　　 1、GMZ-1的體外抗腫瘤活性：
　　 經MTT法測定發(fā)現(xiàn)GMZ-1對多種腫瘤細胞均有較強殺傷作用和抑制生長活性,IC50值范圍為0.066μmol/L～0.27gmol/L,明顯強于同類已上市抗腫瘤藥物依托

5、泊苷(IC50值范圍為1.06μmol/L～14.1μmol/L),且對于同一種細胞的耐藥株與非耐藥株敏感性差別明顯弱于依托泊苷,有較好的抗多藥耐藥作用。同時對人正常成纖維細胞(FB)具有較低毒性,提示GMZ-1對腫瘤細胞有很好選擇性。通過繪制K562/A02細胞生長曲線,發(fā)現(xiàn)低濃度GMZ-1作用下細胞存活數(shù)量高于高濃度作用下的細胞存活數(shù)量,提示GMZ-1的作用具有一定的劑量依賴性。
　　 2、GMZ-1誘導腫瘤細胞凋亡：

6、>　　 GMZ-1能夠誘導K562/A02細胞凋亡,對經過GMZ-1處理后的K562/A02細胞進行染色(所用染料為Giemsa和Hoechst33342),并利用光學和熒光顯微鏡觀察。光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細胞核染色質發(fā)生聚集固縮,細胞核碎裂成多個染色濃密的凋亡小體;熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)同正常細胞微弱藍色熒光相比,GMZ-1處理組細胞出現(xiàn)強亮的藍色熒光,細胞核呈致密濃染。這些都是細胞發(fā)生凋亡的典型形態(tài),且高濃度GMZ-1處理后出現(xiàn)凋亡細胞的數(shù)

7、量多于低濃度。提取經GMZ-1處理后KBV200細胞的總DNA,進行瓊脂糖凝膠電泳,發(fā)現(xiàn)其泳道呈一條一條的梯子狀,為細胞發(fā)生凋亡所出現(xiàn)的典型的“DNA梯子”(DNA ladder)。通過流式細胞儀對GMZ-1處理后的K562/A02細胞凋亡率的測定,發(fā)現(xiàn)在一定濃度和時間范圍內,GMZ-1處理后的細胞凋亡率高于正常細胞凋亡率,且凋亡率隨著濃度的增大和時間的增多而變大。
　　 3、GMZ-1對K562/A02細胞增值周期的影響：

8、r>　　 采用流式細胞儀分析了經GMZ-1處理后K562/A02細胞的周期分布情況,結果顯示,在一定濃度范圍內,GMZ-1作用12h、24h、36h,細胞都發(fā)生G2+M期阻滯。
　　 4/GMZ-1對K562/A02細胞凋亡相關基因p21、p53、Bax、Caspase-3,增殖細胞核抗原PCNA,細胞周期素CyclinA、CyclinB1,多藥耐藥基因Mdr-1等mRNA表達的影響:
　　 RT-PCR分析結果顯示,

9、GMZ-1通過上調抑癌基因p21、p53、BaxmRNA的表達而發(fā)揮誘導腫瘤細胞凋亡的作用;通過上調CyclinA,下調CyclinB1、PCNA而發(fā)揮抑制腫瘤細胞分裂增殖的作用;通過下調Mdr-1基因mRNA的表達而產生抗多藥耐藥作用。
　　 5、GMZ-1對K562/A02細胞凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3和耐藥蛋白Mdr表達的影響：
　　 通過Western-blot分析結果發(fā)現(xiàn),GMZ-1能下調Mdr蛋白的表達,

10、進而發(fā)揮抗多藥耐藥的作用。而對K562/A02細胞Caspase-3的表達影響不明顯。
　　 6、GMZ-1對HepG-2細胞微管聚合的影響：
　　 通過免疫熒光方法觀察到正常HepG-2細胞微管呈致密的網(wǎng)狀分布,熒光強度高,細胞立體感強,而經過GMZ-1處理后的微管,網(wǎng)狀結構稀疏或消失,呈星點狀分布,熒光強度明顯減弱,說明HepG-2細胞微管發(fā)生了解聚。通過免疫熒光半定量法對微管聚合解聚動態(tài)平衡進行測定,結果顯示GMZ

11、-1對微管具有很強的抑制作用,其抑制作用的IC50值為0.066±0.007μmol/L,同鬼臼毒素的0.071±0.007μmol/L相差不大,同時GMZ-1各濃度對應抑制率正負值同長春新堿相似,說明GMZ-1可能和長春新堿一樣發(fā)揮抑制微管聚合的作用。
　　 7、GMZ-1急性毒性試驗：
　　 昆明小鼠腹腔注射GMZ-1后觀察到小鼠出現(xiàn)反應遲鈍、蜷縮不活動、相繼出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,解剖死亡小鼠后發(fā)現(xiàn)大腸或小腸有阻塞,通過各組

12、小鼠最后死亡數(shù)量計算得GMZ-1腹腔注射的LD50值為97.90±19.21 mg/kg(95％confidence interval)。
　　 結論:GMZ-1在體外對多種腫瘤細胞均具有較強的殺傷作用,其對多數(shù)腫瘤細胞的IC50值在0.10μmol/L左右,活性強于依托泊苷10-100倍。多項試驗證明GMZ-1對腫瘤細胞的殺傷作用可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡的方式實現(xiàn)的。GMZ-1能影響腫瘤細胞正常分裂周期,進而抑制腫瘤細胞增殖