菊花CmMET1基因RNAi載體的構(gòu)建及對(duì)菊花和青蒿的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、隨著社會(huì)的發(fā)展，人們?cè)絹碓街匾曈^賞植物的經(jīng)濟(jì)、人文和社會(huì)價(jià)值，因此對(duì)觀賞植物的育種要求也越來越高。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾現(xiàn)象對(duì)菊花（Dendranthema×grandiflora）基因沉默和基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要。為追求更多新穎奇特的育種目標(biāo)，提出了利用RNAi技術(shù)調(diào)控菊花DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)，通過青蒿（Artemisia annuaL.）嫁接傳遞RNAi信號(hào)，進(jìn)而改變菊花基因組DNA甲基化水平，從而誘導(dǎo)其發(fā)生性狀

2、變異的育種新思路。本研究從甲基轉(zhuǎn)移酶CmMET1基因著手，通過RNAi調(diào)控該基因的表達(dá)，促使菊花基因組DNA甲基化水平降低，進(jìn)而創(chuàng)造新的變異類型，主要研究結(jié)果如下：
　?。?）菊花CmMET1基因部分核苷酸序列的多樣性分析
　　通過DNAMAN軟件比對(duì)分析菊花“紫精靈”和青蒿MET1基因的cDNA全長(zhǎng)核苷酸序列，選取4段核苷酸序列設(shè)計(jì)引物對(duì)9個(gè)菊花品種進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，序列比對(duì)分析得出：只有引物Chry2擴(kuò)增的核苷酸序列在菊

3、花品種之間同源性較低，相似率最高只達(dá)到63.74％，且這段序列也是菊花和青蒿之間的非同源序列；其他三對(duì)引物擴(kuò)增得到的核苷酸片段在菊花各品種中差異不明顯，有些品種間甚至沒有差異，相似率的比例范圍在97.43%-100.0%。
　?。?）構(gòu)建RNAi載體
　　選取不同菊花品種間的兩段保守序列，分別位于菊花CmMET1基因第2417到第2515個(gè)堿基以及第1601到第1767個(gè)堿基之間，在其兩側(cè)位置設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別是13

4、6 bp和184 bp。利用“酶切-連接”法成功將目的片段正反向連入RNAi空載體（DHpart27RNAiFADP1P4），并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。
　?。?）建立菊花“紫精靈”和“國(guó)慶紅”莖段愈傷組織誘導(dǎo)和再生體系
　　①“紫精靈”莖段最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基：
　　MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉+2.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L2,4-D，誘導(dǎo)率為76.7%；
　　MS+3%蔗糖+0.7%瓊

5、脂粉+1.0 mg/L6-BA+0.8 mg/L NAA，分化率為75.3%；
　　②“國(guó)慶紅”莖段最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基：
　　MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉+2.0 mg/L6-BA+1.5 mg/L2,4-D，誘導(dǎo)率為63%；
　　MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉+1.0 mg/L6-BA+0.6 mg/L NAA，分化率為63.8%；
　?、鄱咦顑?yōu)生根培養(yǎng)基：
　　MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂

6、粉，生根率均達(dá)到100%。
　?。?）RNAi載體轉(zhuǎn)入菊花
　　將含不同目標(biāo)序列的RNAi載體轉(zhuǎn)入菊花“紫精靈”和“國(guó)慶紅”的愈傷組織。最終在農(nóng)桿菌菌液OD600為0.4-0.5，卡納霉素濃度為10 mg/L的轉(zhuǎn)化條件下分別獲得“紫精靈”和“國(guó)慶紅”的轉(zhuǎn)化植株16株和14株，很多轉(zhuǎn)化植株出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢，矮化，葉柄變長(zhǎng)，葉片變少，葉片白化和死亡等現(xiàn)象。分別選取生長(zhǎng)健壯的“紫精靈”和“國(guó)慶紅”的轉(zhuǎn)化植株8株和6株進(jìn)行卡納標(biāo)記篩選，

7、得到6株和5株陽性轉(zhuǎn)化植株。再各選取2株陽性轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行甲基轉(zhuǎn)移酶CmMET1基因的表達(dá)量檢測(cè)，結(jié)果分析得出，“紫精靈”和“國(guó)慶紅”的陽性轉(zhuǎn)化植株甲基轉(zhuǎn)移酶CmMET1基因表達(dá)量分別為對(duì)照的54%、52.5%和53%、54.5%。
　　（5）RNAi載體轉(zhuǎn)入青蒿
　　青蒿愈傷組織在農(nóng)桿菌菌液OD600為0.5-0.6，卡納霉素濃度為8 mg/L的轉(zhuǎn)化條件下獲得8株轉(zhuǎn)化植株。與青蒿MET1基因序列同源性較高的RNAi載體的轉(zhuǎn)化