柞蠶血淋巴蛋白酶6基因的表達(dá)模式及功能分析.pdf

1、柞蠶（Antheraea pernyi）是鱗翅目大蠶蛾科柞蠶屬的一種絹絲昆蟲，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，已有研究表明絲氨酸蛋白酶在體液免疫(抗菌肽合成與血淋巴黑化)中起到關(guān)鍵作用，為了能夠更全面的了解血淋巴蛋白酶（Hemolymph proteinase6，HP6）在鱗翅目昆蟲先天性免疫中的功能。
　　本論文研究了柞蠶血淋巴蛋白酶6(ApHP6)的表達(dá)模式以及其在體液免疫中生物學(xué)功能。研究結(jié)果如下：
　　1.成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒

2、pET-28a-ApHP6，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了融合蛋白，經(jīng)檢測(cè)成熟的目的蛋白分子量大小為39.6 kDa，和預(yù)測(cè)的分子量一致。在天然條件下利用Ni-NTA親和層析純化對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，獲得了高純度的目的蛋白，免疫新西蘭大白兔獲得抗ApHP6多克隆抗體，并用于后續(xù)的功能分析；
　　2.實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot檢測(cè)分析表明ApHP6在5齡3天幼蟲血細(xì)胞、血淋巴、絲腺、脂肪體、中腸、馬氏管中都有表達(dá)，且ApHP6

3、基因在血細(xì)胞和ApHP6蛋白在血淋巴中高表達(dá)，中腸中表達(dá)量最低；
　　3.對(duì)5齡第3天柞蠶幼蟲分別注射熱滅活大腸桿菌(Escherichia coli)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、白僵菌(Beauveria bassiana)、核型多角體病毒(nuclear polyhedrosis virus)，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血細(xì)胞中ApHP6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和Western Blot檢測(cè)血細(xì)胞、血淋巴中ApHP

4、6的蛋白表達(dá)情況。與注射PBS對(duì)照相比較，結(jié)果表明除 E. coli以外，其他三種病原微生物的免疫刺激，隨著時(shí)間變化都能顯著的影響ApHP6 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，但是影響的時(shí)間和程度都不同；
　　4.利用表達(dá)純化的ApHP6蛋白檢測(cè)了ApHP6對(duì)柞蠶血淋巴proPO激活及PO活性的影響。結(jié)果表明ApHP6蛋白能夠促進(jìn)血淋巴proPO的激活，但是對(duì)PO活性沒有影響；
　　5.將ApHP6蛋白注射進(jìn)柞蠶幼蟲體內(nèi)，30 mi

5、n后注射M. luteus刺激抗菌肽的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明血細(xì)胞中抗菌肽attactin，cecropin，gloverin和moricin及proPO的表達(dá)在mRNA水平上具有顯著性的升高，說明ApHP6蛋白能夠一定程度上激活A(yù)MPs基因和proPO的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。
　　6.注射siRNA-ApHP6后，對(duì)應(yīng)的抗菌肽基因和proPO的表達(dá)水平有明顯下調(diào)。說明ApHP6的RNA干擾后能夠降低柞蠶AMPs和proPO的表