東北紅豆杉(Taxus cuspidata)中非紫杉醇類(lèi)化合物抑制婦科腫瘤細(xì)胞增殖活性及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：自從20世紀(jì)70年代美國(guó)化學(xué)家Wani等從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）的樹(shù)皮中提取一種針狀結(jié)晶物質(zhì)——紫杉醇（Taxol），特別是發(fā)現(xiàn)此物質(zhì)對(duì)癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用以來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者把精力投入到對(duì)該屬植物的化學(xué)成分分析和生理活性的研究上來(lái)，并對(duì)其進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。近年來(lái)，人們已從該屬植物中分離得到紫杉烷二萜、生物堿等化學(xué)成分。其中，尤以紫杉烷類(lèi)成分研究較多。本實(shí)驗(yàn)旨在研究東北紅豆杉中非紫杉醇類(lèi)化合物對(duì)體外培養(yǎng)的人

2、子宮頸癌細(xì)胞株（HeLa）、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株（HEC-1）、人卵巢透明癌細(xì)胞株（SHIN-3）、人卵巢透明癌細(xì)胞株（HOC-21）和人卵巢囊腺癌細(xì)胞株（HAC-2）增殖的抑制作用，并初步探討其抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.腫瘤細(xì)胞株懸液制備
　　 用RPMI1640完全培養(yǎng)液將HeLa等腫瘤細(xì)胞株調(diào)整為濃度2×105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液備用。
　　 2.四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色

3、法
　　 將腫瘤細(xì)胞株懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔50μL（含1×104個(gè)細(xì)胞），分別加入空白對(duì)照磷酸鹽緩沖液、溶劑對(duì)照0.05％二甲基亞砜和陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇以及1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L單體化合物各50μL，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入MTT10μL。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入反應(yīng)停止液150μL，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔吸光

4、度（OD）值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
　　 3.Annexin V-FIFC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)
　　 細(xì)胞傳代進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)組加入50μmol/L的2-Deacetoxytaxinine J，空白對(duì)照組加入磷酸鹽緩沖液，于培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，用250μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整其濃度為1×106/mL，取100μL的細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5μLAnnexin V/FI

5、TC和10μL，20μg/mL的碘化丙錠溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min，在反應(yīng)管中加400μL稀釋后的結(jié)合緩沖液，及時(shí)上流式細(xì)胞儀分析。每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
　　 結(jié)果：
　　 1.四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法結(jié)果顯示：
　　 1.1以1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的Compound1處理HEC-1細(xì)胞48 h后，其生存率分別為95.87％、60.74％和37.92％，并呈現(xiàn)較好的

6、劑量依賴(lài)關(guān)系，其中10Hmol/L和100μmol/L濃度組與空白對(duì)照相比均有顯著性差異（P<0.01）；以100μmol/L的Compound1處理HeLa、SHIN-3、HOC-21和HAC-2細(xì)胞48 h后，其生存率分別為26.93％、52.43％、55.07％和42.32％，對(duì)細(xì)胞增殖顯示較強(qiáng)的抑制活性，與空白對(duì)照組相比，均有非常顯著性的差異（P<0.01）。其中Compound1對(duì)HeLa和HEC-1細(xì)胞的增殖顯示較強(qiáng)的抑制活

7、性，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別約為51.33μmol/L和32.52μmol/L，100μmol/L組與空白對(duì)照組相比均具有非常顯著性的差異（P<0.01）。
　　 1.2以100μmol/L的Compound2處理HeLa和HEC-1細(xì)胞48 h后，其生存率分別為70.29％和69.73％，與空白對(duì)照組相比，具有非常顯著性的差異（P<0.01）；以10μmol/L和100μmol/L的Compound2處理HAC-2細(xì)胞，

8、其生存率分別為87.48％和67.30％，100μmol/L組與空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異（P<0.05）；Compound2用1μmol/L、10μmol/L和10μmol/L處理細(xì)胞，其生存率為86.84％、86.99％和69.36％，對(duì)SHIN-3細(xì)胞增殖顯示較弱的抑制活性。
　　 1.3以100μmol/L的Compound3處理HeLa、HOC-21和HAC-2細(xì)胞48 h后，其生存率分別為64.61％、67.31

9、％和，60.47％，對(duì)細(xì)胞增殖顯示較強(qiáng)的抑制活性，與空白對(duì)照組相比，具有非常顯著性的差異（P<0.01）；用100μmol/L的Compound3處理HEC-1細(xì)胞，其生存率為69.23％，對(duì)HEC-1細(xì)胞增殖顯示較弱的抑制活性，與空白對(duì)照組相比，具有顯著性的差異（P<0.05）；Compound3用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L處理細(xì)胞48 h后，其生存率為88.58％、84.82％和70.75％，對(duì)SHIN-3

10、細(xì)胞增殖顯示較弱的抑制活性，10μmol/L和100μmol/L濃度組與空白對(duì)照組相比，具有非常顯著性差異（P<0.01）。
　　 2.Annexin.V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果
　　 以50μmol/L的Compound1處理HeLa細(xì)胞，結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞早期凋亡率為（48.51±6.84）％，PBS組為（3.47±3.82）％，Compound1的50μmol/L濃度組與PBS組相比，具有顯著性差異（P<0.

11、05）。流式細(xì)胞檢測(cè)進(jìn)～步證實(shí)2-Deacetoxytaxinine J具有明顯誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡的活性，與MTT結(jié)果相符。
　　 結(jié)論：
　　 1.東北紅豆杉中三種非紫杉醇類(lèi)化合物在體外對(duì)HeLa、HEC-1、SHIN-3、HOC-21和HAC-2細(xì)胞增殖有不同的抑制活性。其中2-Deacetoxytaxinine J對(duì)HeLa和HEC-1細(xì)胞的增殖顯示較強(qiáng)的抑制活性。
　　 2.東北紅豆杉中非紫杉醇類(lèi)化