磁性附著體模擬靜磁場(chǎng)對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的基礎(chǔ)研究.pdf

1、脈沖電磁場(chǎng)(pulsed electromagnetic fields,PEMF)作為促進(jìn)骨修復(fù)的一種方法已廣泛應(yīng)用于臨床達(dá)20多年，其促進(jìn)骨折愈合的療效已得到國(guó)內(nèi)外的證實(shí)。然而其作用機(jī)制是磁場(chǎng)效應(yīng)占主導(dǎo)還是電場(chǎng)效應(yīng)為主，直至目前尚未闡明。靜磁場(chǎng)(static magnetic fields,SMF)做為一種良好的力源為修復(fù)體提供輔助固位和作為正畸矯治力矯治錯(cuò)合畸形，且體積小，無(wú)外設(shè)電源，便于長(zhǎng)期局部應(yīng)用，因而正被廣泛應(yīng)用于口腔修復(fù)和正

2、畸領(lǐng)域。最近的研究表明靜磁場(chǎng)能促進(jìn)新骨形成、預(yù)防種植體植入導(dǎo)致的骨密度降低以及促進(jìn)牙槽骨改建。然而有關(guān)靜磁場(chǎng)對(duì)骨組織的生物學(xué)效應(yīng)尚未取得一致結(jié)論，靜磁場(chǎng)對(duì)成骨細(xì)胞(osteoblasts)增殖、分化以及代謝的影響和作用機(jī)制，尚鮮見研究報(bào)道。因此，有必要對(duì)磁性附著體靜磁場(chǎng)對(duì)骨組織的影響作深入研究。 一．研究目的 本課題旨在通過模擬Magnetic 800磁性附著體靜磁場(chǎng)，對(duì)體外培養(yǎng)的SD大鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行三種強(qiáng)度(12.5

3、mT、125mT和250mT)、持續(xù)不同時(shí)間的靜磁場(chǎng)加載，通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)和表面超微結(jié)構(gòu)觀察、增殖活力和細(xì)胞周期分布及凋亡分析、ALP和OCN活性測(cè)定、TGF-β<,1>mRNA的合成以及原癌基因c-jun表達(dá)的測(cè)定，從細(xì)胞、亞細(xì)胞、分子及基因水平上研究磁性附著體靜磁場(chǎng)對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)、增殖、分化和代謝的影響，探討靜磁場(chǎng)對(duì)骨組織的影響，從而為磁性附著體的臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 二．研究方法 1．對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行靜磁場(chǎng)加載

4、，通過倒置相差顯微鏡觀察活細(xì)胞形態(tài)，HE染色光鏡觀察以及掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)，研究靜磁場(chǎng)對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)的影響，并探討其影響機(jī)理。 2．對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行靜磁場(chǎng)加載，通過MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布，細(xì)胞凋亡分析。研究靜磁場(chǎng)對(duì)成骨細(xì)胞增殖特性的影響。 3．對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行靜磁場(chǎng)加載，通過酶聯(lián)免疫技術(shù)測(cè)定堿性磷酸酶活性，放射免疫技術(shù)檢測(cè)骨鈣素的合成，探討靜磁場(chǎng)對(duì)成骨細(xì)胞合成礦化蛋白的影響。

5、 4．靜磁場(chǎng)加載成骨細(xì)胞，采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈技術(shù)檢測(cè)TGF-β<,1>mRNA的表達(dá)水平，從基因水平研究靜磁場(chǎng)對(duì)成骨細(xì)胞合成細(xì)胞因子的影響。 5．靜磁場(chǎng)加載成骨細(xì)胞，利用熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合免疫組化技術(shù)，檢測(cè)立即早期基因c-jun mRNA以及表達(dá)產(chǎn)物的變化，從蛋白水平和基因水平，探討靜磁場(chǎng)影響成骨細(xì)胞的作用機(jī)制。 三．結(jié)果 1．三種不同靜磁場(chǎng)強(qiáng)度持續(xù)加載成骨細(xì)胞1到7天，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，均未

6、觀察到靜磁場(chǎng)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、排列及分布的影響。125mT和250mT靜磁場(chǎng)加載3天，兩磁場(chǎng)處理組細(xì)胞表面微絨毛增多，并且融合形成微囊泡，加載5和7天后，細(xì)胞表面微囊泡數(shù)目增多，．形成較大微囊泡，還可見囊泡的破裂。12.5moT靜磁場(chǎng)持續(xù)加載5天和7天后，細(xì)胞表面出現(xiàn)較多的微囊泡。 2．三種不同靜磁場(chǎng)強(qiáng)度持續(xù)加載成骨細(xì)胞1到7天，對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯促進(jìn)作用，各組細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，無(wú)明顯的劑量一效應(yīng)、時(shí)間一效應(yīng)關(guān)系。各磁場(chǎng)組對(duì)細(xì)胞的各

7、周期分布、增殖指數(shù)及細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯影響。 3．靜磁場(chǎng)加載1天，各磁場(chǎng)組對(duì)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性無(wú)明顯。靜磁場(chǎng)加載3天，125mT和25mT磁場(chǎng)組ALP活性增強(qiáng)；靜磁場(chǎng)加載5天和7天，12.5mT、125mT和250mT各磁場(chǎng)強(qiáng)度組ALP活性明顯升高；而且125mT和250mT磁場(chǎng)組ALP活性明顯高于12.5mT；磁場(chǎng)組。持續(xù)靜磁場(chǎng)作用會(huì)增加ALP活性，存在時(shí)間一效應(yīng)關(guān)系。靜磁場(chǎng)加載1

8、天和3天，對(duì)成骨細(xì)胞分泌骨鈣素(Osteocalcin,OCN)無(wú)明顯影響；靜磁場(chǎng)持續(xù)作用5天和7天，各磁場(chǎng)強(qiáng)度組骨鈣素分泌明顯增強(qiáng)，不同磁場(chǎng)強(qiáng)度之間骨鈣素分泌無(wú)明顯差別，無(wú)明顯劑量一效應(yīng)關(guān)系。 4．在整個(gè)觀察期內(nèi)，靜磁場(chǎng)抑制TGF-β<,1>mRNA表達(dá)水平的下降。125mtT和250mT磁場(chǎng)加載組細(xì)胞的FGF-β<,1>tmRNA的表達(dá)水平，在各時(shí)段都明顯高于對(duì)照組和12.5mT磁場(chǎng)加載組相應(yīng)時(shí)間段；12,5mT磁場(chǎng)加載組在

9、加載12小時(shí)、1天和3天，細(xì)胞的TGF-β<,1>mRNA的表達(dá)增強(qiáng)。 5．在整個(gè)觀察期內(nèi)，各磁場(chǎng)加載組細(xì)胞內(nèi)c-jun mRNA和蛋白產(chǎn)物的表達(dá)呈二過性升高：12.5mT磁場(chǎng)加載組加載6和12小時(shí)，c-jUnmRNA和蛋白產(chǎn)物的表達(dá)明顯升高，以后逐漸下降；125mT和250mT磁場(chǎng)加載組從加載2小時(shí)開始c-jun mRNA和蛋白產(chǎn)物的表達(dá)立即顯著升高，且分別持續(xù)到6小時(shí)和12小時(shí)，明顯高于對(duì)照組和12.5mT組。呈現(xiàn)一定的劑量

10、一效應(yīng)關(guān)系。 四．結(jié)論 磁性附著體模擬靜磁場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠成骨細(xì)胞的形態(tài)、排列、增殖活性，細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯影響，而靜磁場(chǎng)能使細(xì)胞合成c-jun、TGF-β<,1>、ALP和OCN的功能發(fā)生改變。推測(cè)靜磁場(chǎng)可能通過影響成骨細(xì)胞對(duì)c-jun的表達(dá)而影響啟動(dòng)序列中含有AP-1結(jié)合位點(diǎn)的基因如TGF-β<,1>、ALP和OCN等的表達(dá)，刺激其表達(dá)升高，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的分化，代謝和成熟。然而靜磁場(chǎng)對(duì)成骨細(xì)胞