水稻白葉枯病隱性抗病基因xal3的分離與鑒定.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文水稻白葉枯病隱性抗病基因xal3的分離與鑒定姓名：儲昭暉申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：張啟發(fā);王石平20051201華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文2 0 0 5中文摘要植物抗病基因的研究一直以來是植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，迄今已經(jīng)從不同的宿主中分離了5 0 多個抗病基因，其中僅有6 個是隱性基因，這些隱性抗病基因的作用機(jī)理目前尚不能用廣為接受的顯性基因的作用機(jī)理來進(jìn)行解釋．水稻中已經(jīng)鑒定

2、3 2 個主效抗白葉枯病基因，其中9 個為隱性抗病基因。位于第8 染色體長臂末端的x a l 3基因就是其中的一個典型，它完全隱性抗性、特異性的抗白葉枯病菌菲律賓菌系生理小種6 ( P X 0 9 9 ) 、和其它顯性或隱性抗白葉枯病基因存在抗性互作，說明x a l 3 基因抗病機(jī)理的特異性．為克隆x a l 3 基因，采用基因組飽和雜交的原理，在9 個發(fā)育時期取材構(gòu)建了水稻品種明恢6 3 全生育期均一化c D N A 文庫．以分子標(biāo)記

3、E 6 a 和另一端標(biāo)記S 1 4 0 0 3 為起始，構(gòu)建了x a l 3 基因區(qū)段的物理圖譜，并結(jié)合3 個F 2 群體和S h o t g u n 測序結(jié)果將該基因定位f 一個9 ．2 k b 的D N A 片段上。同時通過精細(xì)物理定位x a l 3 基因，開發(fā)了數(shù)個與該基因緊密連鎖的基于P C R 技術(shù)的分子標(biāo)記，為采用分子標(biāo)記輔助選擇x a l 3 育種提供了經(jīng)濟(jì)、方便的分子標(biāo)記。在優(yōu)化了一套適合于水稻品種I R B B l 3

4、 的轉(zhuǎn)基因組培體系的基礎(chǔ)上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將攜帶顯性候選基因的片段轉(zhuǎn)入到攜帶隱性抗病基因的水稻品種I R B B l 3 中，在4 5 株轉(zhuǎn)基因植株后代中，有全長基因?qū)氲? 0 株的袁型變?yōu)楦胁?，并? 個單拷貝轉(zhuǎn)基因的T l 代家系也符合共分離檢測，從而驗(yàn)證了候選基因是x a l 3 基因的顯性基因X a l 3 ，標(biāo)志用圖位克隆法成功克隆了隱性基因x a l 3 和顯性基因X a l 3 。同時，通過R N A 干

5、擾( R N A i ) 技術(shù)，分別抑制水稻品種明恢6 3 和中花I l 中顯性基因X a l 3的表達(dá)，以及水稻品系I R B B l 3 中隱性基因的表達(dá)．通過接種自葉枯病菌P X 0 9 9 和定量R T - P C R 分析發(fā)現(xiàn)，明恢6 3 和中花l l 中X a l 3 基因表達(dá)受到抑制的植株表型由感病變?yōu)榭共　? R B B l 3 中x a l 3 基因表達(dá)受到抑制的植株抗性進(jìn)一步加強(qiáng)。有趣的是，顯性基因X a l 3 和

6、隱性基因x a l 3 在花藥中的表達(dá)量高于二在葉片中的表達(dá)盛。R a N A i 轉(zhuǎn)基因植株中X a l 3 或x a l 3 的表達(dá)受到抑制會導(dǎo)致植株不育或半不育，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)這些不育單株的多數(shù)花粉的發(fā)育停留在單核花粉期或二核花粉期。原位雜交的實(shí)驗(yàn)證明， 腸鄺基因在花藥中表達(dá)的時期與異?；ǚ郯l(fā)生的時期1 # 常一致．X a l 3住花粉發(fā)育的早期不表達(dá)，在單核花粉期開始高水平表達(dá)。從而說明X a l 3 基因在花粉的發(fā)育中也起著重

7、要的作用．進(jìn)一步通過大量實(shí)驗(yàn)表明，顯性基因X a l 3 是一個受病原調(diào)控表達(dá)的基因，由顯性瑤岡X a l 3 突變成隱性基因x a l 3 的關(guān)鍵不是編碼區(qū)內(nèi)的變化，而是在啟動子區(qū)的一個約1 8 b p 的區(qū)間內(nèi)的突變使基因表達(dá)受病原調(diào)控的能力喪失，且這種突變不影響其在花粉中的表達(dá)。X A l 3 蛋白是～個未知具體生化功能的細(xì)胞膜蛋白，屬于M t N 3 家族的成員之一．但其在白葉枯病菌P X 0 9 9 侵染以及在花粉的發(fā)育中發(fā)揮