番石榴葉提取物輔助降血糖作用及其機制研究.pdf

1、近年來，全球糖尿病患病率呈逐年上升趨勢。2002年我國成人糖尿病患病率為2.6％，估計全國糖尿病現(xiàn)患人數(shù)2000多萬，到2025年將達(dá)到3800萬。糖尿病是一組因胰島素絕對或相對缺乏引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。慢性高血糖產(chǎn)生葡萄糖毒性作用，與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，嚴(yán)格控制血糖，是糖尿病治療的基本要求，尋找方便易行、安全可靠的控制血糖方法，對糖尿病的預(yù)防和治療顯得十分重要。 番石榴葉具有輔助降血糖作用，其

2、作用機制和功效成分研究尚不廣泛深入。我國番石榴自然資源豐富，海南、廣東、廣西、臺灣、福建、云南、貴州和四川等省、自治區(qū)有引種種植或遺為野生的種類。四川攀枝花地區(qū)野生番石榴葉輔助降血糖作用未見研究報道。 本文研究攀枝花地區(qū)野生番石榴葉提取物輔助降血糖作用及其機制，為開發(fā)利用番石榴葉野生資源提供參考依據(jù)。 全文從以下三部分進(jìn)行研究： 1、番石榴葉提取物制備和及其輔助降血糖作用比較 目的：制備番石榴葉水提取物和

3、不同濃度乙醇提取物，比較不同提取物對糖尿病小鼠輔助降血糖作用，篩選安全、有效的降血糖提取物。 方法：采摘攀枝花地區(qū)野生番石榴葉，清洗、晾干、打碎，分別用蒸餾水、65％和95％食用乙醇浸提，浸提液過濾、濃縮、干燥(乙醇提取物用乙醚脫脂)后，研磨成粉得水提取物(WE)、65％乙醇提取物(AE65)和95％乙醇提取物(AE95)。選用雄性昆明種小鼠，鏈脲佐菌素(STZ)80mg/kg腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病。WE、AE65和AE95懸液灌胃

4、4周，降血糖藥物格列吡嗪(Glipizide)作為降血糖效果陽性對照，比較三種提取物輔助降血糖效果，比較各組小鼠生長情況。 結(jié)果： WE、AE65和AE95等三種提取物得率分別為14.5％、22.0％和11.0％。三種提取物均可明顯降低糖尿病小鼠禁食3h空腹血糖，在1.25g/kg劑量水平，AE95組小鼠血糖降低31.3％，降血糖程度明顯低于Glipizide組(43.2％)；WE和AE65組小鼠血糖分別降低36.3％和33.5

5、％，降血糖程度低于Glipizide，但三者差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義；三種提取物中，WE對小鼠的體重影響較小。WE的1.25、2.5和5.0g/kg三個劑量中，低劑量和中劑量組小鼠血糖下降差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義，對糖尿病小鼠體重增長的影響與模型對照組和Glipizidc陽性對照組相似；高劑量WE組小鼠血糖降低45.4％，和Glipizide相近，但對小鼠體重增長影響較大。 結(jié)論：番石榴葉水提取物、65％乙醇提取物和95％乙醇提取物均具有輔

6、助降血糖作用；水提取物安全性較高。 2、 番石榴葉水提取物輔助降血糖作用機制研究 2.1 番石榴葉水提取物對小腸粘膜α-葡萄糖苷酶活性的影響 目的：研究番石榴葉水提取物(WE)對小腸粘膜α-葡萄糖苷酶的抑制作用。 方法：選用雄性昆明種小鼠，STZ腹腔注射(80mg/kg)誘導(dǎo)糖尿病模型。以小鼠小腸粘膜生理鹽水勻漿液用作α-葡萄糖苷酶待測液，與雙糖底物孵育，比色法測定葡萄糖產(chǎn)量代表α-葡萄糖苷酶的活性。比較

7、正常對照組小鼠和糖尿病小鼠小腸粘膜α-葡萄糖苷酶活性，測定WE對糖尿病小鼠小腸粘膜α-葡萄糖苷酶活性的影響，Lineweaver-Burk作圖判斷WE對α-葡萄糖苷酶抑制作用類型。 結(jié)果：WE對糖尿病小鼠小腸粘膜蔗糖酶和麥芽糖酶具有較強的抑制作用，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，抑制作用類型為部分競爭性和非競爭性混合型。 結(jié)論：番石榴葉水提取物具有抑制糖尿病小鼠小腸α-葡萄糖苷酶作用，減緩腸道碳水化合物消化吸收可能是其輔助降血糖作用機

8、制之一。 2.2 番石榴葉水提取物對肝臟糖代謝的調(diào)節(jié)作用 目的：研究番石榴葉水提取物(WE)對糖尿病小鼠肝臟糖代謝的影響，探討輔助降血糖作用分子生物學(xué)機制。 方法：雄性昆明種小鼠，鏈脲佐菌素(STZ)80mg/kg腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病模型。實驗小鼠分為正常對照組、糖尿病模型對照組和WE輔助降血糖組，WE按2.5g/kg劑量灌胃4W，葡萄糖溶液灌胃進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)，丙氨酸溶液腹腔注射進(jìn)行12h空腹糖

9、異生實驗；小鼠脫頸椎處死，測定肝糖原含量，實時熒光定量PCR(Real-time PCR)測定肝組織中葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)和肝糖原合酶(Gys-2)等糖代謝關(guān)鍵酶mRNA水平。 結(jié)果：與正常對照組小鼠相比，糖尿病模型對照組小鼠3h和12h空腹血糖(21.29和12.76mmol/L)明顯升高，口服葡萄糖耐量明顯減低(AUC=48.11)，丙氨酸注射1h和2h糖異生率明顯升高(36.5％和59.1％)

10、，肝糖原含量(3.01 mg/g)明顯減少。WE灌胃4周后，與糖尿病模型對照組小鼠相比，WE灌胃組小鼠3h和12h空腹血糖(14.09和8.04mmol/L)明顯降低，口服葡萄糖耐量明顯改善(AUC=36.81)，丙氨酸注射1h和2h糖異生率明顯降低(23.7％和38.5％)，肝糖原含量(3.87mg/g)明顯升高。糖尿病模型對照組小鼠肝組織中GK mRNA水平明顯下降，只是正常對照組小鼠的1.3％；G6pc mRNA水平明顯上升，達(dá)到

11、正常對照組小鼠的3.0倍； Gys-2 mRNA水平?jīng)]有明顯變化。WE灌胃處理，糖尿病小鼠肝GKmRNA水平明顯升高，是模型對照組小鼠的6倍；G60c mRNA水平呈下降趨勢，Gys-2 mRNA水平呈上升趨勢。 結(jié)論：番石榴葉水提取物可能通過調(diào)節(jié)糖尿病小鼠體內(nèi)肝臟糖代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)和改善胰島素分泌來提高組織對葡萄糖的吸收利用能力，促進(jìn)肝糖原合成，減少糖異生，從而起到輔助降血糖作用。 2.3 番石榴葉水提取物抗氧化和胰

12、島保護(hù)作用 目的：研究番石榴葉水提取物(WE)抗氧化作用，觀察WE對胰島保護(hù)和損傷修復(fù)作用，為WE減輕機體組織氧化損傷提供依據(jù)。 方法：體外實驗測定WE對羥自由基清除率和脂質(zhì)過氧化抑制率。WE對肝臟糖代謝的調(diào)節(jié)作用研究(2.2)中小鼠脫頸椎處死，取肝組織測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量；取胰腺常規(guī)HE染色和胰島素抗體免疫組化(HIC)染色，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察和圖像

13、灰度分析，比較小鼠胰島組織病理學(xué)變化。 結(jié)果：WE具有清除羥自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。與正常對照組小鼠相比，糖尿病模型對照組小鼠肝組織SOD水平(163.46U/mg protein)和GSH水平(27.96mg/g protein)明顯下降，CAT水平(389.4U/g protein)呈下降趨勢；WE灌胃處理后，糖尿病小鼠抗氧化能力提高，肝組織GSH水平(32.79 mg/g protein)明顯升高，SO

14、D和CAT水平(199.23和411.7U/g protein)出現(xiàn)上升趨勢。糖尿病小鼠胰島出現(xiàn)明顯的病理損傷，胰島數(shù)量、密度、體積減少；胰島內(nèi)分泌細(xì)胞減少、細(xì)胞變性，胰島素陽性表達(dá)的β細(xì)胞減少，胰島素表達(dá)強度減弱。WE處理后，糖尿病小鼠胰島病理損傷減輕，胰島的數(shù)目和體積增加，表達(dá)胰島素的β細(xì)胞數(shù)量增加，β細(xì)胞胰島素表達(dá)強度增強。 結(jié)論：番石榴葉水提取物具有較強的抗氧化能力，通過保護(hù)糖尿病小鼠胰島、減輕β細(xì)胞氧化損傷，恢復(fù)和改善

15、β細(xì)胞合成分泌胰島素功能，可能是番石榴葉水提取物輔助降血糖作用機制之一。 3、番石榴葉提取物中輔助降血糖功效成分初步分析 目的：初步探討番石榴葉提取物輔助降血糖功效成分。 方法：紫外分光光度法分析番石榴葉水提取物(WE)、65％乙醇提取物(AE65)和95％乙醇提取物(AE95)中總黃酮含量，高效液相色譜(HPLC)和紫外可見吸收光譜法(UV)對黃酮類化合物初步鑒定；電感耦合等離子體一原子發(fā)射光譜法(ICP)測定

16、提取物中Mg、Cr、V等礦物質(zhì)含量。比較分析番石榴葉提取物中各成分含量與輔助降血糖效果之間關(guān)系。 結(jié)果：番石榴葉提取物主要含有槲皮素為苷元的黃酮類化合物，WE、AE65和AE95三種提取物總黃酮含量分別為3.28、30.71和55.98g/kg;WE中Mg、Cr、V等礦物質(zhì)含量均比較高(分別為9259.08、11.41和49.54 mg/kg)，AE65中三種礦物質(zhì)較少，AE95中三種礦物質(zhì)含量最低。 結(jié)論：番石榴葉提取